TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN



tải về 1.48 Mb.
trang1/13
Chuyển đổi dữ liệu08.07.2016
Kích1.48 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   13
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------

Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI



TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Mã số: 60420114

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS. Nguyễn Văn Minh và CN. Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm.

Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Y tế Thái Bình, Trưởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được đi học nâng cao trình độ của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành chương trình học Cao học.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi hoàn thành khóa học.




Hà Nội, tháng 12 năm 2015

HVCH: Bùi Thị Khánh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN …..…………………………………………………………... ii


MỤC LỤC …..…………………………………………………………………….. iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi


LỜI CẢM ƠN …..…………………………………………………………... ii v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi v

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào 6

1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa 7

1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào 9

1.1.3.1. Hệ gen ty thể 10

1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể 12

1.1.3.3. Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể 13

1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA 17

1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein 19

1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA 21

1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA 22

1.3.1.1. Đột biến A8344G 25

1.3.1.2. Đột biến T8356C 26

1.3.1.3. Đột biến G8363A 26

1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học 31

2.1. NGUYÊN LIỆU 33

2.1.1. Mẫu bệnh phẩm 33

2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác 33

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 33

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số 34

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1. THU THẬP MẪU MÁU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 42

3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích 42

3.1.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu 42

3.2. SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP 43

3.2.1. Sàng lọc đột biến A8344G 43



3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR 43

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 44



3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP 45

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR 47

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 47



3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP 48

3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363A 49



3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582 49

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 50



3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP 51

3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 53



3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 53

3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G 55

3.3.2. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến A8344G 57



3.3.2.1. Xác định số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G 57

3.3.2. 2. Xây dựng đường chuẩn của đột biến A8344G 57

Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR 58

Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR 58

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn 59

3.2.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến A8344G 60

3.3.1. Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155 - 9292 trên hệ gen ty thể. 62

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate

ANT Adenine nucleotide translocase

ADP Adenosine diphosphate

ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair (cặp bazơ)

BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang)

CoQ Coenzyme Q

CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên)

Cyt c Cytochrome c

Cyt b Cytochrome b

D-loop Vòng chuyển vị

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng)

EtBr Ethidium bromide

FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng khử)

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

kb Kilobase

KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS)

LB Luria Bertani

LHON Leber’s hereditary optic neuropathy

(Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)

LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like

Episodes (Hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả

tai biến mạch)

MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres

(Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều)

MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

(Bệnh tiểu đường và câm điếc di truyền theo mẹ)

MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ)

mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

nDNA Nuclear DNA (DNA nhân)

NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử)

NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos

(Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PEO Progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)

ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng)

SDS Sodium dodecylsulphate

TAE Tris -Acetate-EDTA

TBE Tris -Borate-EDTA

TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi)

DANH MỤC CÁC BẢNG


LỜI CẢM ƠN …..…………………………………………………………... ii v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi v

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 44

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 47

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 50

Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR 58

Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR 58

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn 59

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64


DANH MỤC CÁC HÌNH

LỜI CẢM ƠN …..…………………………………………………………... ii v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi v

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 44

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 47

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 50

Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR 58

Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR 58

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn 59

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64


MỞ ĐẦU

Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng cung cấp năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Ty thể sản xuất năng lượng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H2O, CO2, và năng lượng dưới dạng ATP.

Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân. DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. DNA ty thể dễ bị tổn thương do ty thể là môi trường giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức khác nhau.

Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON). Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người đã được xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau.

MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hưởng đến hệ thần kinh và cơ xương cũng như các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thể. Ngoài ra, người mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh, mất điều hòa vận động, suy nhược và mất trí nhớ. Triệu chứng thường khởi phát ở trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thường, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát được các u mỡ khu trú dưới da. Tế bào cơ bất thường và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dưới kính hiển vi.

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phương pháp thăm khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thường quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn chưa được phát hiện và không có phương pháp điều trị hiệu quả.

Ở Việt Nam, gần như chưa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến MERRF ở người Việt Nam.

Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“.




: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP


  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   13


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương