TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR
tải về 1.48 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR
- Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn
- 3.2.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến A8344G
- Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155 - 9292 trên hệ gen ty thể.
Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR
Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCRA: Các đường cong biểu thị mức độ nhân bản của các đoạn gen đích, B: Đồ thị thể hiện tương quan giữa logarit số bản sao gen mang đột biến A8344G (đỏ) và không mang đột biến (xanh) với giá trị chu kỳ ngưỡng. Kết quả phân tích real-time PCR (Hình 3.9) cho thấy đường chuẩn màu xanh là của DNA không mang đột biến và màu đỏ là dạng DNA mang đột biến, tạo ra bằng việc sử dụng các tỷ lệ nồng độ khác nhau giữa plasmid chứa đoạn gen ty thể mang đột biến A8344G và không mang đột biến có độ tuyến tính cao, giá trị của hệ số tương quan R2 giữa số bản sao DNA ty thể và số chu kỳ ngưỡng với mẫu dò Wt-8344A-FAM (không mang đột biến) là 0,999 và Mt-8344G-HEX (mang đột biến) là 0,999, hiệu quả PCR nằm trong khoảng 94-100%. Slope của probe Wt-8344A-FAM là -3,458, probe Mt-8344G-HEX là -3,317. Nhằm kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn tỷ lệ đột biến bằng cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến là 0,01% - 100% đột biến bằng cách trộn plasmid mang đột biến và không đột biến với các thể tích nồng độ tương ứng (Bảng 3.7). Sau đó chúng tôi tiến hành định lượng mẫu chuẩn và xây dựng đồ thị sự tương quan tuyến tính giữa phần trăm tỷ lệ độ biến thực tế và lí thuyết. Đánh giá độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp (Hình 3.10). Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn
Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn.
Hình 3.10. Sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết Kết quả thu được ở hình 3.10 cho thấy giới hạn phát hiện đột biến của phương pháp thiết lập được là 0,1%, sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ đột biến thực tế và lý thuyết có độ tin cậy cao (R2 = 0,997). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Như vậy đường chuẩn chúng tôi thiết lập được có độ tin cậy và độ nhạy tương đương với nghiên cứu của Trương Thị Huệ và tập thể (2012) trong việc xây dựng đường chuẩn định lượng đột biến A3243G bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq man LNA (độ nhạy đạt 0,1%, R2=0,999) [1]. 3.2.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến A8344GTrong 312 mẫu bệnh phẩm đã sàng lọc bằng phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi không phát hiện được trường hợp nào mang đột biến A8344G. Để khẳng định thêm về kết quả này chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) và thử nghiệm bằng phương pháp real-time PCR đã được thiết lập ở trên. Kết quả định lượng ở hình 3.11 cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm được thử nghiệm chỉ thu được tín hiệu FAM, là tín hiệu không đột biến trong khi đó tín hiệu HEX là tín hiệu đột biến đều không phát hiện được. Đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao (R2 > 0,99). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Vì vậy chúng tôi một lần nữa khẳng định 5 mẫu bệnh phẩm này đều không mang đột biến A8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phương pháp PCR-RFLP và real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang LNA.  Hình 3.11. Thử nghiệm định lượng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR
Như đã nêu ở trên, qua sàng lọc bằng PCR-RFLP, chúng tôi đã không phát hiện được trường hợp nào mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A thuộc hội chứng MERRF. Để một lần nữa khẳng định kết quả nghiên cứu bằng PCR-RFLP là chính xác chúng tôi đã lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ (Phụ lục 1) bị hội chứng MERRF với triệu chứng rõ nhất để giải trình tự đoạn gen 8155 - 9292 thuộc vùng các đột biến này.
Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp của 29 bệnh nhân nghi bị MERRF được chúng tôi nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm được nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide sử dụng mồi theo cả hai chiều. Kết quả phân tích trình tự thu được cho thấy không có trường hợp nào mang đột biến A8344G, T8356C và G8363A của hội chứng MERRF (Hình 3.12). Như vậy, kết quả xác định trình tự một lần nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP là chính xác và đáng tin cậy. 
Hình 3.12. Kết quả blast của trình tự đoạn gen ty thể 8155 - 9292 của 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2 Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP tải về 1.48 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
