TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số

Hỗn hợp tách DNA chứa 20 µl protease Qiagen, 200 µl mẫu máu, 200 µl đệm AL và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp được trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây để thu được một dung dịch đồng nhất và được ủ ở 56^oC trong 10 phút. Sau đó hỗn hợp được ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp được bổ sung 200 µl ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống được chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột được loại bỏ. Cột được bổ sung 500 µl AW1 và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó dịch đi qua cột được loại bỏ. Cột tiếp tục được cho thêm 500 µl AW2, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột được loại bỏ. Cột được chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và được bổ sung 150 µl nước cất vô trùng và để yên trong 1 phút, sau đó được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là DNA tổng số. Mẫu được bảo quản ở -20^oC cho đến khi sử dụng.

Sự có mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl DNA được trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên giếng gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel, các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

Nồng độ của DNA tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A₂₆₀) trên máy Nano-Drop. Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A₂₆₀) của các phân tử DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các phân tử DNA, với hệ số A₂₆₀ = 1 tương đương với hàm lượng DNA sợi đôi là 50 μg/ml, sử dụng công thức C = A₂₆₀ x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lượng DNA có trong mẫu tách chiết.

Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ hấp thụ có thể bị ảnh hưởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Vì vậy, trong thực tế phương pháp này thường được dùng để định lượng các mẫu DNA tinh khiết, tỉ số A₂₆₀/A₂₈₀ được sử dụng để đánh giá độ sạch DNA của chế phẩm. DNA được cho là sạch khi giá trị A₂₆₀/A₂₈₀ nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.

Đoạn gen ty thể mang đột biến MERRF được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế và chế độ nhiệt thích hợp. Khuôn cho PCR là DNA tổng số được tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Theo tính toán lý thuyết, các đoạn gen chứa đột biến sẽ được nhân lên bằng kĩ thuật PCR với kích thước 212 bp (đột biến A8344G), 220 bp (đột biến T8356C), 241 bp (đột biến G8363A).

Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10X; 1 µl Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl); 2,5 µl dNTPs 2 mM; 1 µl mồi xuôi 10 pmol; 1 µl mồi ngược 10 pmol; 2 µl DNA khuôn (40 - 45 ng/µl) và 15 µl ddH₂O cho tổng thể tích 25 µl. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, đặt vào máy PCR và tiến hành chạy với 3 bước chính: biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình nhiệt được thiết lập như bảng 2.1.

Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF

Mẫu đối chứng âm tính (không chứa DNA) được đặt cùng thí nghiệm để kiểm tra khả năng nhân bản không đặc hiệu.

Sản phẩm phản ứng sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%. Sau khi PCR kết thúc, 5 µl sản phẩm được trộn đều với 1 µl dung dịch đệm tra mẫu có chứa ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml, tra lên giếng gel đã chuẩn bị trong đệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 bp được điện di song song cùng với mẫu. Điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu cách mép bản gel khoảng 2 cm. Bản gel chứa các băng DNA được quan sát trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).

2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP)

Đoạn gen chứa đột biến được nhân bản bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong đệm tương ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần như sau: 1 µl đệm enzyme giới hạn 10X; 0,5 µl enzyme giới hạn (50 đơn vị/µl); 7,5 µl sản phẩm PCR và 6,25 µl ddH₂O cho tổng thể tích 15 µl, hỗn hợp phản ứng được giữ ở 37ºC, từ 12-16 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và đột biến được phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.

Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng, kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.

6. 
   Điện di trên gel polyacrylamide
   

Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G được định lượng bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến và HEX (535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3’của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tương ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher).

Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (T_m) và tính đặc hiệu của mẫu dò, trong trình tự của mẫu dò còn có cải biến bằng nucleotide dạng khóa (locked nucleic acid) (Hình 2.1).