Enzyme Glucoamylase gvhd: pgs. Ts lê Văn Việt Mẫn



tải về 2.96 Mb.
trang1/6
Chuyển đổi dữ liệu06.06.2018
Kích2.96 Mb.
  1   2   3   4   5   6

Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Mục lục

Lời nói đầu 1

Tài liệu tham khảo 44


Lời nói đầu


Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được là các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học. Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase, 8906 tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác … Ở các nước phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh.

Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại α – amylase, β – amylase, γ – amylase hay glucosamylase, oligo – 1,6 – glucosidase, transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm.

Hiện nay Glucoamylase là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm. Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là α – glucose, nên Glucoamylase được sử dụng trong quy trình sản xuất α – glucose. Glucose có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng Glucoamylase trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam.


  1. Tổng quan về nguyên liệu

  1. Enzyme glucoamylase

Giới thiệu chung

Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh vật khác cũng như ở mô động vật.

Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme. Các glucoamylase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Glucoamylase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại glucoamylase II không có cả hai tính chất này.


    1. Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase

Glucoamylase I và glucoamylase II. Cả hai dạng glucoamylase đều là những chuổi glyco – protein, trong phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D – galactose, thành phần carbonhydrate trong phân tử glucoamylase I chiếm khoảng 18%, còn với phân tử glucoamylase II là 10%.

Phân tử carbonhydrate tham gia trong thành phần cấu tạo enzyme glucoamylase đóng vai trò giúp ổn định cấu trúc enzyme. Ngoài ra chúng còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide giúp cho vùng xúc tác trên enzym gần với cơ chất hơn, do đó quá trình thủy phân của enzyme thuận lợi hơn.

Thành phần acid amine tham gia tạo thành chuổi polypeptid trong phân tử glucoamylase cũng khác nhau khi enzyme glucoamylase được thu nhận từ các nguồn khác nhau

Số lượng acid amine tham gia vào chuổi polypeptid cấu tạo nên phân tử glucoamylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus awamori khoảng 650 – 700 acid amin.



Các acid amin chính tham gia trong trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase bao gồm acid glutamic, tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic, lysin, serin. Trong đó acid glutamic ở vị trí thứ 179 và 400 đóng vai trò chính trong việc xúc tác thủy phân liên kết O – glucozit của cơ chất.



Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase

    1. Cấu trúc không gian enzym glucoamylase

Trong không gian, phân tử glucoamylase được chia làm ba vùng với chức năng riêng biệt:

  • Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích thước khoảng 30 A0. Giữ chức năng liên kết với phân tử cơ chất.

  • Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A0, giữ chức năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit.

  • Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng trên lại với nhau.



Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase

    1. Các tính chất của glucoamylase

  • Enzym glucoamylase có mã số EC: 3.2.1.3

  • Tên khoa học: glucan 1,4 – α – glucohydrolase

Ngoài ra enzym glucoamylase còn có các tên gọi khác như: amyloglucosidase; γ – amylase; lysosomal α – glucosidase; acid maltase; exo – 1,4 – α – glucoside; glucose amylase; γ – 1.4 – glucan glucohydrolase.

Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 – 1,6 o – glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Gốc gluco từ đầu không khử được gọi là glycone, còn chuổi oligosaccharide sau khi gluco được tách ra thì được gọi là Alglycone.

Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucozit). Acid glutamic ở vị trí thứ 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucozit của phân tử cỏ chất sẽ bị phá vỡ.



    1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase

      1. Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym, khi tăng nhiệt độ lên 100C thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên gấp đôi, nhưng khi tăng nhiệt độ lên quá cao vượt quá nhiệt độ tối ưu thì enzyme bắt đầu biến tính, do đó vận tốc phản ứng của enzyme cũng giảm xuống. Mỗi enzyme sẽ hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, enzyme glucoamylase hoạt động trong khoảng 200C – 750C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym glucoamylase: 400C – 650C.

      1. pH

pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzym, là do pH thay đổi có ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym như nhóm α – COOH, ω – COOH, – NH2, – OH. Vòng imodazol… cũng như trạng thái ion hóa của cơ chất và của phức chất trung gian ES.

Khoảng pH mà enzym glucoamylase hoạt động được là từ 2 – 8, pH tối ưu: 4 – 5.5



      1. Các chất ức chế

Enzyme glucoamylase sẽ bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Hg2+, Pb2+, Ni2+,Cu2+. Ngoài ra, khi cơ chất là tinh bột thì schardinger dextrin sẽ hoạt động như một chất ngăn cản khả năng taog phức hợp giữa enzyme glucoamylase và tinh bột. với cơ chất là maltose thì trong môi trường có sự hiện diện của gentitobiose, mantitol với nồng độ khoảng 20mM sẽ ức chế hoạt động của enzyme glucoamylase

      1. Các chất hóa học

Khi cho thêm vào môi trường phản ứng các dung môi như: chloroform, hexane, n – deoecane với nồng độ khoảng 50% sẽ làm tăng hoạt tính glucoamylase lên 2 lần so với môi trường chỉ có nước là chất dung môi duy nhất. Các chất 2,2’ – dipyridyl, iodoacetamyde sẽ làm tăng hoạt tính enzym glucoamylase.

    1. Tính chất của glucoamylase

Cơ chế tác động

Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside của phân tử tinh bột.





Hình 1.3: Sơ đồ phân giải của enzyme glucoamylase

Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực xúc tác thuỷ phân tinh bột. Vì thế việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các chủng vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có một ý nghĩa triển vọng rất lớn. Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là glycone, chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone.

Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O – glucoside là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucoside). Acid glutamic ở vị trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucoside của phân tử cơ chất sẽ bị phá vỡ.

Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose. Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt ở các liên – 1,4 và – 1,6 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợpchất lên men được và do đó nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu là tinh bột.



Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật tuy có những điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau. Ngay cả các chế phẩm được tách từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng khác nhau, thậm chí ngay cả các chủng cùng loài cũng khác nhau về các đặc điểm về tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu với cơ chất và điều kiện hoạt động. Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải theo cơ chế đơn mạch. Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase:

Group 79

Phản ứng cho ra 80 – 85 % glucose



    1. Ứng dụng của enzym glucoamylase

Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … được thay thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.

Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, do đó cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều enzym glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt của Aspergillus Usamii và Aspergillus Balatae.

Nếu coi tổng lượng đường maltose, glucose, saccharose, fructose là 100% thì khi đường hóa bằng malt ta có 71% maltose, 24 – 28% glucose, còn khi đường hóa bằng amylase nấm mốc sẽ có 14 – 21% maltose, 80 – 85% glucose, sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân bởi amylase nấm mốc chủ yếu là glucose – đường dễ lên men, do vậy sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn

Glucose được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như y học, trong công nghiệp thực phẩm. ngày nay việc sản xuất glucose đa số được sử dụng công nghệ enzyme. Enzyme glucoamylase là enzyme chủ yếu cho quá trình đường phân tinh bột để tạo thành glucose. Tinh bột có chỉ số DE khoảng 4 – 8, sau khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase thì chỉ số DE tăng lên 96 – 98. Dung dịch sau thủy phân có thể trực tiếp được sử dụng để sản xuất siro giàu fructose hoặc là sản xuất glucose ở dạng tinh thể.

Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase còn được bổ sung vào một số loại thuốc giúp tăng khả năng tiêu hóa cho cơ thể.

Ngày nay, enzyme glucoamylase còn được sử dụng kết hợp với các enzyme cellulase và protease dưới dạng canh trường nấm mốc bổ sung vào trong thức ăn gia súc, làm tăng quá trình đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh hơn.



  1. Nấm mốc Aspergillus niger

    1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger

Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,…có giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ…

Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cố, hạt bắp…; Aspergillus niger cũng được phân lập từ các sản phảm lên men cổ truyền



    1. Vị trí phân loại của Aspergillus niger

Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này.

Raper and Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần. Như vậy Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau:



Bảng 1.1: Phân loại Aspergillus niger

Giới

Fungi

Lớp

Fungi imperfecti

Bộ

Moniliales

Họ

Aspergillaceae

Loài

Aspergillus niger
  1   2   3   4   5   6


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2016
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương