TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA
tải về 1.48 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu
Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNANguyên tắc của phương pháp: Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích. Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn, huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ do nguyên lý cộng hưởng năng lượng huỳnh quang (nguyên lý FRET), ống phản ứng sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì mẫu dò huỳnh quang sẽ bắt cặp với khuôn và bị hoạt tính 5’-exonuclease của enzyme Taq DNA polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung, do vậy reporter sẽ rời xa quencher và phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích (Hình 2.2). Sự phân cắt của mẫu dò trong quá trình PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lượng reporter tự do càng nhiều và cường độ huỳnh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận được. 
Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real- time PCR
Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA Đoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291 - 8370 được nhân bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến được phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX. Thành phần của phản ứng real-time PCR gồm qPCR master mix (2X), 1 µmol/L mỗi loại mồi, 0,125 µmol/L mỗi loại mẫu dò (Wt-8344A-FAM/Mt-8344G-HEX) và 10 ng DNA khuôn cho tổng thể tích 25 l. Real-time PCR được thực hiện với chế độ nhiệt 95°C, 10 phút tiếp nối 40 chu kỳ với 95°C, 15 giây để biến tính và 60°C, 60 giây để bắt cặp và kéo dài chuỗi. Cường độ tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận và phân tích bởi hệ thống iQ5 cycler (Biorad). Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn và mẫu phân tích có các đường biểu diễn khuếch đại tương ứng. Từ giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) của mẫu nghiên cứu, dựa vào đường chuẩn được thiết lập bằng cách trộn mẫu DNA plasmid mang đột biến và không mang đột biến với các tỷ lệ khác nhau từ đó tính ra phần trăm đột biến của mẫu phân tích. Dãy DNA plasmid từ 5.102-5.107 bản sao/µl (hệ số pha loãng 10) chứa trình tự đột biến và không đột biến được trộn theo tỷ lệ 1:1 ở cùng nồng độ chạy cùng với mẫu trong mỗi phản ứng. Lượng đột biến trong mỗi mẫu được đo 3 lần (n = 3) và số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê.
Trình tự đoạn gen được xác định dựa theo phương pháp Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddNTP) thông qua dịch vụ phân tích bởi Công ty 1st base (Singapore). Do ddNTP chỉ chứa đầu 3’-H thay cho 3’-OH nên khi các nucleotide này được gắn vào chuỗi DNA đang được tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Theo đó, từ một đoạn DNA khuôn ban đầu sẽ tổng hợp nên nhiều đoạn sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng là ddNTP và các đoạn này có độ dài hơn kém nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn đó được phân tách trên gel acrylamide dạng mao quản và máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích kết quả để đưa ra trình tự đoạn DNA gốc. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. THU THẬP MẪU MÁU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tíchMẫu máu từ các bệnh nhi có độ tuổi từ 1 tháng đến 15 tuổi, trẻ dưới 5 tuổi (từ 1 tháng tuổi đến 5 tuổi) được nghiên cứu chiếm tỷ lệ 87,5%, từ 6 đến 15 tuổi chiếm tỷ lệ 12,5%. Trong đó, tỷ lệ nam là 57,1%, nữ là 43,9%. Theo các dẫn liệu chẩn đoán lâm sàng bởi các bác sĩ Bệnh viện Nhi Trung ương, các bệnh nhi lấy mẫu nghiên cứu đều xuất hiện các triệu chứng của bệnh thần kinh cơ (encephalomyopathy) như động kinh co giật, rối loạn chuyển hóa, chậm phát triển tinh thần vận động, tăng acid lactic máu. 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫuDNA tổng số từ 200µl mẫu máu của bệnh nhân được tách theo Kit của Qiagen (Mục 2.3.1.), chế phẩm DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.1) cho thấy các chế phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DNA rõ nét, với độ di động điện thấp (gần vạch xuất phát), chứng tỏ DNA tổng số tách được đều nguyên vẹn. 
Hình 3.1. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA 1 kb (-): Đối chứng âm 1-5: DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân Kết quả đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở 260 nm của chế phẩm DNA tổng số (Phụ lục 1) cho thấy các mẫu DNA đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế phẩm DNA ít lẫn protein hay RNA. Hàm lượng DNA trung bình đạt 44,5 ng/µl. Như vậy, chúng tôi đã thu được các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP tải về 1.48 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|