TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP
tải về 1.48 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366
- 3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP
- 3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR
- Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358
- 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP
- 3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363A
- 3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582
3.2. SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP3.2.1. Sàng lọc đột biến A8344G3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCRĐể xác định sự thay đổi nucleotide G thành A tại vị trí 8344 trên mtDNA chúng tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen có kích thước 212 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi Trương Thị Huệ và tập thể [56], như bảng 3.1. Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (Hình 3.2) cho thấy sản phẩm DNA khuếch đại của đoạn gen có kích thước như tính toán lý thuyết (212 bp), điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen 8155 - 8366 từ mẫu DNA tổng số của các bệnh nhân. 
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366 M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm (không chứa DNA khuôn) (+): Sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến A8344G 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân 3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLPĐoạn gen chứa đột biến sau khi được khuếch đại bằng PCR và kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2% được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen 8155 - 8366 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành ba đoạn có kích thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp; trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ cắt thành bốn băng với kích thước lần lượt là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp, đột biến làm xuất hiện điểm cắt của enzyme BanII khiến băng 72 bp bị cắt thành hai băng 50 bp và 22 bp (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII
Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại (Mục 2.2.6). 
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA (-): Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344A (+):Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP (hình 3.3) cho thấy các mẫu DNA nhân bản của bệnh nhân (đường chạy 4 - 10) đều xuất hiện 3 băng có kích thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với sản phẩm cắt của plasmid không mang đột biến, trong khi đó đối chứng dương là plasmid mang đột biến bị cắt thành 4 băng có kích thước tương ứng là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp (đường chạy thứ 3). Chứng tỏ, kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy, các mẫu bệnh nhân (nêu ở đây là 7 bệnh nhân) được sàng lọc không mang đột biến A8344G. Thực tế, chúng tôi đã sàng lọc đột biến A8344G ở 312 bệnh nhân và không phát hiện thấy bệnh nhân nào mang đột biến A8344G. 3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356C Tiếp tục sàng lọc các đột biến thuộc hội chứng MERRF, chúng tôi tiến hành điều tra đột biến T8356C trên 182 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty thể (Phụ lục 1) bằng phương pháp PCR-RFLP theo các bước tương tự như trên. 3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCRĐoạn gen chứa đột biến T8356C phải được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được thiết kế bởi Trương Thị Huệ và tập thể [56], như bảng 3.3, chúng tôi nhân bản được đoạn DNA từ vị trí 8166 đến 8358, với kích thước 220 bp. Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2% (Hình 3.4) cho thấy chỉ có một băng DNA duy nhất, kích thước 220 bp được nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR là đúng so với những tính toán lý thuyết. 
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385 M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm (+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến T8356C 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLPSản phẩm PCR ở trên được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn DraI. Enzyme này sẽ nhận điểm cắt có trình tự TTT/AAA trên đoạn gen 8166 - 8385 không chứa đột biến và cắt đoạn DNA 220 bp thành hai đoạn có kích thước tương ứng là 192 bp và 28 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến không có trình tự này nên không bị cắt. Kiểm tra sản phẩm cắt bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. 
Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA (+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356C (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356T 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân Phổ băng điện di cho thấy tất cả sản phẩm PCR của các mẫu bệnh nhân (đường chạy 2-8) đều bị cắt thành 2 đoạn DNA có kích thước 192 bp và 28 bp (hình 3.5) giống như tính toán lý thuyết, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến T8356C. Thực tế, chúng tôi đã điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trường hợp nào mang đột biến T8356C. 3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363ANhằm xác định nguyên nhân gây ra triệu chứng lâm sàng trên những bệnh nhân đã được lấy mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiếp tục sàng lọc đột biến G8363A trên 182 bệnh nhân có biểu hiện mắc hội chứng MERRF nói trên (Phụ lục 1). 3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582Chúng tôi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với sợi xuôi và sợi ngược của đoạn mtDNA nghiên cứu, được thiết kế dựa trên trình tự gen ty thể, như bảng 3.4, để nhân lên đoạn DNA có kích thước 241 bp (8342 - 8582) sử dụng khuôn là mẫu DNA tổng số được tách từ mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP tải về 1.48 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||