TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582
tải về 1.48 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP
- 3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA
- 3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G
- 3.3.2. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến A8344G
- 3.3.2. 2. Xây dựng đường chuẩn của đột biến A8344G
Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2% cho kết quả (Hình 3.6) là một băng DNA duy nhất có kích thước 220 bp được nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR là đáng tin cậy so với những tính toán lý thuyết. 
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582 M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm (+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến G8363A 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLPSản phẩm PCR ở trên được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn NlaIII. Theo tính toán lý thuyết, enzyme NlaIII sẽ nhận biết điểm cắt GTAC đoạn gen 8166 - 8385 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thước tương ứng là 220 bp và 21 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ không bị cắt. Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. 
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA (+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363A (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân Phổ băng điện di trên đường chạy 2-8, cho thấy tất cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DNA 220 bp và 21 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến G8363A. Thực tế, chúng tôi đã điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trường hợp nào mang đột biến G8363A. Hiện nay có rất nhiều phương pháp có thể áp dụng để phát hiện ra sự có mặt của đột biến A8344G trên gen ty thể như PCR-RFLP, SSCP, xác định trình tự gen, DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), real-time PCR. Tuy nhiên, PCR-RFLP vẫn là một kỹ thuật phân tử đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sàng lọc thông dụng một lượng mẫu lớn. Cao và tập thể đã sử dụng PCR-RFLP để sàng lọc 1.559 mẫu bệnh nhân và phát hiện 158 trường hợp mang đột biến mtDNA gây bệnh, tất cả các trường hợp được khẳng định lại bằng xác định trình tự gen đều phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP [16]. Bốn bệnh nhân Trung Quốc mang đột biến A8344G trong nghiên cứu của Yu Qi và cộng sự, đã được giải trình tự cho kết quả tương tự như kết quả PCR-RFLP [44]. Trương Thị Huệ và tập thể [55] đã nghiên cứu sàng lọc đột biến gen ty thể bằng phương pháp PCR-RFLP trên 106 bệnh nhân Việt Nam, nhưng cũng không phát hiện được bệnh nhân nào mang đột biến A8344G và T8356C. Trong các đột biến gây nên hội chứng MERRF thì hơn 80% là A8344G, còn đột biến T8356C và G8363A chỉ khoảng 10-20%. Trên thế giới đã có nhiều công bố về sàng lọc đột biến A8344G trên bệnh nhân cơ não ty thể với kết quả đáng chú ý như nghiên cứu của Qi và cộng sự [44] điều tra đột biến gen ty thể trên 552 bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể, ở miền Bắc Trung Quốc, bằng phương pháp PCR-RFLP, phát hiện 4 bệnh nhân mang đột biến A8344G (chiếm 0,72%); Cũng một nghiên cứu khác trên 124 bệnh nhân Trung Quốc nghi mắc hội chứng Leigh, Zhang và cộng sự đã phát hiện ra 2 bệnh nhân mang đột biến A8344G (1,61%) [63]; Kwon và tập thể [36], khi nghiên cứu đột biến gen ty thể trên 65 bệnh nhân Hàn Quốc, đã phát hiện được 3 trường hợp mang đột biến A8344G (4,6%). Như vậy, có thể thấy tần suất phát hiện đột biến A8344G trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể liên quan nhiều đến cách lấy mẫu điều tra ban đầu và có thể còn những nguyên nhân khác nữa cần được làm rõ. 3.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘT BIẾN A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNAViệc thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe về cơ bản được thực hiện theo các nguyên tắc thiết kế mồi chung cho PCR. Đột biến điểm A8344G (MERRF) được chúng tôi nghiên cứu định lượng bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman khóa cầu methyl. Kỹ thuật này được phát triển dựa vào enzyme Taq DNA polymerase có hoạt tính 5’-exonuclease khi mẫu dò được gắn vào cùng sợi khuôn với mồi và phản ứng cắt này chỉ xảy ra khi gen đích được khuếch đại. Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, được đánh dấu reporter và quencher. Khi mẫu dò nguyên vẹn, quencher làm hấp thu tín hiệu huỳnh quang từ reporter do sự cộng hưởng năng lượng huỳnh quang (nguyên lý FRET) do khoảng cách giữa reporter và quencher khá gần nhau. Sự phân cắt của mẫu dò trong khi PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang và máy đo tín hiệu huỳnh quang sẽ ghi nhận được tín hiệu. Đây là phương pháp phát hiện và định lượng đột biến nhanh, nhạy và chính xác, có giá trị khi xác định tỷ lệ đột biến mtDNA thấp. Đột biến A8344G là đột biến không đồng nhất, sử dụng real-time PCR với mẫu dò Taqman thông thường đã cho tín hiệu nền cao do việc gắn không đặc hiệu của mẫu dò vào trình tự đích vì vậy không có giá trị để xác định tỷ lệ đột biến thấp. Vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ đột biến A8344G thì một trong những thách thức cơ bản là thiết kế mẫu dò Taqman phải có khả năng phân biệt được các gen đích chỉ khác nhau một nucleotide. Điều này đạt được khi khoảng cách ΔTm giữa Tm của mẫu dò bắt cặp hoàn toàn (mẫu dò match) và Tm của mẫu dò bắt cặp không hoàn toàn (mẫu dò mismatch) càng lớn. Khoảng ΔTm càng lớn thì việc lựa chọn nhiệt độ bắt cặp/kéo dài trong phản ứng PCR bên trong khoảng ΔTm càng thuận lợi, mẫu dò sẽ bắt cặp chính xác hơn. Trong thí nghiệm này, mẫu dò huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến và HEX (535/556) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến, còn đầu 3’ của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tương ứng (quencher) là BFQ (Black Fluorescence Quencher). Với mục đích tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dò, mẫu dò bắt cặp đúng và bắt cặp sai cần có nhiệt độ tách chuỗi (Tm) cao hơn (Tm) của mồi khoảng 10oC và mẫu dò phải ngắn thì tác động của sự thay đổi một nucleotide càng lớn nên mẫu dò bắt cặp đặc hiệu hơn. Vì vậy, chúng tôi đã cải tiến mẫu dò Taqman dưới dạng Taqman LNA. LNA là dạng acid nucleic có chứa nucleotide cải biến với cầu methyl giữa vị trí oxy 2’ và carbon 4’ của gốc đường. Liên kết này đã hạn chế tính linh động của nucleotide bị khóa nên làm tăng độ bền nhiệt và độ đặc hiệu của mẫu dò trong quá trình lai. Điều này làm cho mẫu dò Taqman LNA hấp dẫn hơn khi sử dụng để phát hiện đột biến điểm trên hệ gen ty thể. Dựa trên nguyên tắc đã phân tích, chúng tôi đã thiết kế mẫu dò Taqman LNA đặc hiệu để phát hiện đột biến A8344G bằng real-time PCR (Bảng 3.5).
Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA 3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344GĐoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 được nhân bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến được phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX. Các thử nghiệm kiểm tra mẫu dò được thực hiện sử dụng DNA khuôn là plasmid đột biến và không đột biến được pha loãng 5.106 bản sao/µl. Qua nhiều lần thăm dò, chúng tôi đã xác định được nồng độ mẫu dò thích hợp cho phản ứng real-time PCR là 0,02 µmol/L mỗi loại mẫu dò cho 25l thể tích phản ứng; với hàm lượng mẫu dò này thì cường độ huỳnh quang được ghi nhận là cao nhất. Nhiệt độ bắt cặp của mồi và mẫu dò là 60oC, đây là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mẫu dò Taqman, với nhiệt độ bắt cặp này mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi đích trước khi mồi bắt cặp, nhờ đó enzyme Taq DNA polymerase dễ dàng thủy phân mẫu dò, giúp cho việc phát huỳnh quang của reporter. Đoạn DNA ty thể chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến được phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-FAM với các plasmid mang đột biến và không mang đột biến ở nồng độ 5x106 bản sao để kiểm tra sự hoạt động của mẫu dò và tính đặc hiệu của probe.
B: Mẫu dò với plasmid không mang đột biến 8344A Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò (probe) Kết quả phân tích real-time PCR (hình 3.8) cho thấy khi chạy real-time PCR với plasmid mang đột biến 8344G thì tín hiệu huỳnh quang chỉ lên với kênh HEX trong khi phản ứng chứa đồng thời cả 2 mẫu dò Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-FAM. Tương tự, với plasmid không mang đột biến (tức chỉ là A8344), thì chỉ có tín hiệu FAM. Kết quả này khẳng định mẫu dò mà chúng tôi thiết kế có khả năng phân biệt đặc hiệu mẫu đột biến và mẫu không đột biến. 3.3.2. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến A8344G3.3.2.1. Xác định số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344GĐể xây dựng đường chuẩn của đoạn gen mang đột biến A8344G thuộc hội chứng MERRF bằng real-time PCR, plasmid mang DNA có đột biến và không đột biến A8344G được chuẩn bị ở các nồng độ bản sao khác nhau, dựa trên kích thước hay trọng lượng phân tử và nồng độ của DNA plasmid thu nhận được. Cụ thể, chúng tôi đã tính được số bản sao của plasmid 8344A = 2,1 x 1010 bản sao, plasmid 8344G = 1,7 x 1010 bản sao Số bản sao của 2 plasmid được pha loãng về cùng một nồng độ là 1 x 1010 bản sao/µl và được pha loãng theo hệ số 10 dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.2. 2. Xây dựng đường chuẩn của đột biến A8344GSử dụng khuôn là hỗn hợp plasmid đột biến và không đột biến theo tỷ lệ 1:1 có nồng độ 5x107 - 5x102 bản sao /l. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn có số chu kỳ ngưỡng khác nhau tương quan với số lượng DNA đích ban đầu (Bảng 3.6). Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP tải về 1.48 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
