CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào

Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c. Tác động của Cyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase (Apaf-1), tổ hợp lại với nhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome. Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóa procaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn sự chết tế bào. Bcl-2 điều hòa con đường apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào chất. Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngược lại, ức chế sự giải phóng Cyt c từ đó kìm hãm sự chết của tế bào [32, 60].

Nồng độ Ca²⁺ trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào. Sự kích hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca²⁺ trong ty thể phải đủ lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c và hoạt hóa caspase. Mặt khác, khi một lượng lớn Ca²⁺ tích tụ trong ty thể, sẽ tương tác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làm chất nền bị trương lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c. Hơn nữa, Ca²⁺ còn kích thích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS). Sự dư thừa ROS trong ty thể hoạt động như chất trung gian của các con đường truyền tín hiệu chết theo chương trình [34].

Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố làm tổn thương gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chương trình.

3. 
   Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể
   

1.1.3.1. Hệ gen ty thể

ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (NADH-ubiquinone oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ được mã hóa bởi mtDNA (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hợp V (ATP synthase). Các phân tử protein còn lại của chuỗi hô hấp được mã hóa bởi gen nhân, được dịch mã trong tế bào chất, sau đó được vận chuyển vào bên trong ty thể [59].

Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóa xen kẽ với vùng mã hóa. D-loop nằm giữa gen tRNA^Phe (gen MT-TK) và tRNA^Pro (gen MT-TP) là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản. Hai gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA được nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11].

Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong ty thể nhưng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa. Quá trình phiên mã và dịch mã của DNA ty thể lại được điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen ty thể được phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã sau đó được endonuclease phân cắt để hình thành nên phân tử rRNA 12S và 16S, tRNA và mRNA tiền thân. Phân tử mRNA hoàn thiện của ty thể không được gắn mũ nhưng có đuôi polyA. Mô hình phiên mã trên có nhiều điểm giống với một operon của vi khuẩn [11, 59].

Các tế bào người có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtDNA trong một tế bào và có số lượng dao động tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của từng loại tế bào. Số bản sao mtDNA giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhưng dường như tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng. Số lượng bản sao mtDNA thay đổi rất lớn ở các mô khác nhau và được kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trình phát triển của động vật. Số bản sao mtDNA tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46].

1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhưng hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trưng cho chúng. Đột biến mtDNA được truyền từ mẹ sang con nhưng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất khác nhau [29, 46].

Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiện của gen đột biến giữa mẹ và con cái. Ví dụ, một người mẹ khỏe mạnh mang đột biến mtDNA có thể sinh ra hai người con với tần suất mang gen đột biến hoàn toàn khác nhau, một người con khỏe mạnh và một người con có biểu hiện bệnh trầm trọng ngay từ khi còn nhỏ. Kiểu di truyền này được gọi là “nút cổ chai”, theo đó tần suất mang mtDNA đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũng khác với mẹ [14, 46, 50].

1.1.3.3. Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể

Số bản sao mtDNA đột biến so với tổng lượng mtDNA của tế bào sẽ xác định mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đa số các đột biến mtDNA gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy. Những hiểu biết về mức độ dị plasmid của người mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên lượng được tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14].

mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DNA trong nhân, do hệ gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone như hệ gen nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54]. Ngoài ra, ty thể không có cơ chế sửa chữa DNA hiệu quả như với DNA trong nhân. Hiện nay, đã có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh được phát hiện và nghiên cứu. Các đột biến gen ty thể này thường gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể.

1. 
   ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN
   

1. 
   Các loại đột biến gen ty thể
   

Hầu hết những thay đổi trên DNA ty thể là đa hình và có vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự di cư của con người. Những đột biến mtDNA gây bệnh đầu tiên đã được xác định vào năm 1988. Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh đã được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là đột biến điểm và đột biến cấu trúc. Các đột biến mtDNA có tính không đồng nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn. Ước tính ở phía Đông Bắc nước Anh có tỷ lệ 1/10.000 người đã có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 người có nguy cơ mắc bệnh. Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy tần số đột biến là 0,14% đối với đột biến A3243G và 0,2% đối với đột biến A1555G liên quan đến MT-RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56].

1. 
   Đột biến điểm
   

tRNA ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRNA trong tế bào chất (mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng hình L của tRNA, ảnh hưởng đến cấu trúc bậc ba của chúng. Một số đột biến trên tRNA ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS. Tùy thuộc vào điểm đột biến trên gen tRNA ty thể sẽ ảnh hưởng đến các kênh vận chuyển điện tử khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào. Các nguyên nhân gây ra khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp các tRNA ty thể là rất nhiều bao gồm: kết thúc phiên mã, biến đổi tRNA trưởng thành, thay đổi bộ ba đối mã, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tRNA do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm liên kết với các yếu tố dịch mã mtEFT hoặc các ribosome ty thể. Đột biến điểm ở gen mã hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hưởng đến các chức năng của phức hợp chuỗi hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm [56].

Đột biến điểm trên mtDNA chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau. Một số đột biến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang được nghiên cứu nhiều hơn, đột biến này thường ảnh hưởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc trưng. Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ đột biến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa [31].

2. 
   Đột biến cấu trúc mtDNA
   

Ở cấp độ phân tử, khoảng 60% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra trong khu vực mtDNA mà hai bên là trình tự lặp ngắn, kiểu mất đoạn này được gọi là đột biến mất đoạn type I. Khoảng 30% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra tại những vùng có trình tự lặp không tuyệt đối, được gọi là mất đoạn type II. Còn lại khoảng 10% đột biến mất đoạn xảy ra ở vùng không có trình tự lặp. Mất đoạn mtDNA phổ biến nhất, gặp ở khoảng 1/3 số bệnh nhân, là đột biến mất đoạn 5 kb (8470 - 13447) được giới hạn bởi trình tự lặp 13 bp (type I) [24].

Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, hầu hết đột biến mất đoạn mtDNA đều có đặc điểm chung, chủ yếu xảy ra từ quá trình sao chép. Cơ chế xảy ra đột biến cũng giống nhau, Krishnan và cộng sự [24] đã đề xuất rằng mất đoạn mtDNA phát sinh trong quá trình sửa chữa các sai hỏng trong phân tử mtDNA tái bản. Số lượng nucleotide bị mất và tần suất xuất hiện của đột biến trong các mô là cơ sở quan trọng cho việc xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh, nhưng có thể không tỷ lệ thuận với nhau.

2. 
   Các bệnh do đột biến gen ty thể
   

Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu hiện của bệnh ty thể chịu sự chi phối của một số yếu tố bao gồm hiệu ứng ngưỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lượng bản sao DNA được nhân lên trong ty thể, và sự di truyền “nút cổ chai”. Nhiều đột biến gen gây bệnh ty thể ở trạng thái không đồng nhất, trong trường hợp này thì tỷ lệ gen đột biến có liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh. Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cần thiết có thể gây nên những biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đến biểu hiện lâm sàng của bệnh được gọi là ngưỡng biểu hiện của đột biến. Giá trị ngưỡng này khác nhau đối với từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong cơ thể; sự hô hấp của tế bào theo con đường hiếu khí sẽ bị ảnh hưởng sớm hơn so với con đường kị khí. Thông thường các giá trị ngưỡng trong khoảng 60 - 90% gen đột biến mtDNA [14]. Trong quá trình phân bào, ty thể được tách ngẫu nhiên và trong tế bào con sẽ không có sự đồng nhất về tỷ lệ đột biến mtDNA, sự thay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngưỡng biểu hiện của bệnh. Mặt khác, mỗi ty thể của tế bào có hàng ngàn bản sao DNA dẫn đến sự thay đổi tỷ lệ mtDNA đột biến trong tế bào và mô. Cơ chế di truyền “nút cổ chai” cũng quyết định sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của người mẹ mang đột biến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu nhiên lượng mtDNA đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng nhất ở tế bào hợp tử cao hơn hay thấp hơn ngưỡng biểu hiện của bệnh [46].

Từ việc xác định được các đột biến mtDNA đầu tiên vào năm 1988, sau đó đã có nhiều nghiên cứu quan trọng đi sâu tìm hiểu những rối loạn di truyền mtDNA dẫn đến tình trạng bệnh lý. Hiện nay, đã có hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh được xác định. Ngoài ra còn có nhiều báo cáo về các đột biến gen nhân làm thay đổi protein trong chuỗi hô hấp của ty thể gây nên bệnh ty thể. Những nghiên cứu này làm sáng tỏ cơ chế phân tử của bệnh ty thể, đặc biệt tập trung vào các khuyết tật di truyền mtDNA, hệ quả chức năng đặc trưng của đột biến mtDNA nhằm mang lại sự tiến bộ về phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ty thể.

1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA

Hầu hết bệnh nhân MELAS đều bị tích tụ acid lactic trong cơ thể dẫn đến nhiễm toan làm nôn mửa, đau bụng, rất mệt mỏi, yếu cơ và khó thở. Một số trường hợp MELAS co thắt cơ không tự chủ, giảm thính lực, bệnh tim và thận, tiểu đường, mất cân bằng nội tiết tố [40].

Nguyên nhân là do một trong các loại đột biến A3243G, A3251G, T3271C, T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNA^Leu; đột biến G13513A, A12770G và A13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I, G583A trên gen MT-TF mã hóa cho tRNA^Phe, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNA^Val, A5814G trên gen MT-TC mã hóa cho tRNA^Cys. Trong đó, đột biến A3243G chiếm 80% số ca mang hội chứng MELAS, tiếp theo là đột biến T3271C xảy ra khoảng 7,5% [16]. MELAS có thể gây ra bởi các đột biến điểm mtDNA ở các gen khác như COXIII, ND1, ND5 hoặc gen mã hóa tRNA^Phe, tRNA^Val, tRNA^Cys, rRNA hoặc mất đoạn với kích thước ngắn. Tuy nhiên, đột biến trên tRNA^Leu vẫn là đột biến phổ biến nhất liên quan đến kiểu hình MELAS. Trong số đó, đột biến A3243G được báo cáo đầu tiên trên gen mã hóa cho tRNA^Leu và là đột biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc [1]. Như vậy, đột biến A3243G là một chỉ tiêu quan trọng để chẩn đoán hội chứng MELAS ngoài các kiểm tra lâm sàng.

Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội chứng liệt cơ mắt ngoài tiến triển do rối loạn chức năng ty thể, thường gặp ở người lớn. Triệu chứng điển hình của bệnh là liệt cơ mắt, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và đột tử.

CPEO là một bệnh tiến triển chậm, có thể bắt đầu ở mọi lứa tuổi và tiến triển trong khoảng thời gian 5 đến 15 năm. Các triệu chứng đầu tiên xuất hiện thường là mí mắt sụp xuống làm giảm giới hạn vận động của mắt, hạn chế tầm nhìn của mắt, và tổn thương giác mạc. Bệnh nhân thường sử dụng cơ trán để giúp nâng mí mắt nên có thể xảy ra teo các nhóm cơ trên mặt, khó khăn trong việc nhai, một số bệnh nhân đục thủy tinh thể, suy giảm thính giác, đau thần kinh sợi trục, mất điều hòa co cơ, Parkinson [56].

CPEO là tình trạng bệnh gây nên bởi những khuyết tật trong ty thể làm ảnh hưởng đến quá trình phosphoryl oxy hóa trên chuỗi hô hấp tế bào. Trong một số trường hợp, đột biến ở gen MT-TL1 trên mtDNA gây nên CPEO. Nguyên nhân của bệnh là do đột biến A3243G nằm trên gen mã hóa tRNA^Leu(UUR) và đột biến T4274C nằm trên gen mã hóa tRNA^Ile. Mất đoạn mtDNA là nguyên nhân quan trọng gây nên hội chứng CPEO, những mất đoạn có kích thước 3,4 đến 6,9 kb với mức độ không đồng nhất dao động trong khoảng 18,8 đến 85,5% cho thấy các biểu hiện lâm sàng khác nhau. Một nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể ở Malaysia cho thấy rằng độ dài, vị trí mất đoạn và mức độ không đồng nhất đóng vai trò quan trọng trong việc xác định kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân CPEO, hai bệnh nhân nặng được tìm thấy mất đoạn mtDNA có kích thước 4320 bp và 4717 bp. Bệnh nhân CPEO có thể mang đột biến điểm, bao gồm các đột biến trên tRNA^Leu, tRNA^Ile và tRNA^Asp. Mặt khác, các đột biến gen POLG, SLC25A4 và C10orf2 trên DNA nhân cũng là nguyên nhân gây bệnh, những gen này rất quan trọng để bảo vệ mtDNA. Mặc dù cơ chế chưa rõ ràng, nhưng đột biến bất kỳ trong 3 gen này đều dẫn đến mất đoạn lớn trên mtDNA, dao động từ 2-10 kb [17].

1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein

Hội chứng Leigh và NARP (yếu cơ do thần kinh, mất điều hòa và viêm sắc tố võng mạc) là một phần của chuỗi các rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển gây ra bởi sự bất thường của chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể [53].

Hội chứng Leigh đặc trưng bởi tình trạng thoái hóa thần kinh tiến triển, trong đó đặc biệt ảnh hưởng đến não, não trung gian và hạch thần kinh, thường dẫn đến tử vong do suy hô hấp. Các dấu hiệu đầu tiên ở trẻ mắc hội chứng Leigh là nôn mửa, tiêu chảy, khó nuốt dẫn đến ăn uống kém, không phát triển, giảm trương lực cơ, co cơ không kiểm soát, mất cảm giác và yếu ở các chi, triệu chứng phổ biến là cử động khó khăn. Một số cá nhân liệt cơ mắt, teo dây thần kinh thị giác, phì đại cơ tim. Ngoài ra, khó thở thường gặp ở những người mắc hội chứng Leigh dẫn đến suy hô hấp, hoặc sự tích tụ lactate trong cơ thể đo được ở máu, dịch não tủy và nước tiểu [56].

NARP được đặc trưng bởi yếu cơ do thần kinh gây mất cảm giác thần kinh, mất điều hòa và bệnh võng mạc sắc tố. Triệu chứng khởi phát là mất điều hòa vận động và trí tuệ chậm phát triển, thường xuất hiện ở trẻ em. Một số bệnh nhân NARP có thể tương đối ổn định trong nhiều năm, nhưng có thể bị xuống cấp từng đợt, thường có biểu hiện rõ ràng khi kết hợp với các bệnh do virus [66].

Hầu hết các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh được báo cáo là trên các gen MT-ATP6, MT-ND3 và MT-ND5, một vài đột biến được xác định trên các gen MT-ND2, MT-ND6 và MT-ND4. Ngoài ra, còn có trường hợp trên gen liên quan đến quá trình tổng hợp protein, đó là gen MT-TV mã hóa cho tRNA^Val, gen MT-TL1 mã hóa cho tRNA^Leu, gen MT-TW mã hóa cho tRNA^Trp và gen MT-TK mã hóa cho tRNA^Lys. MT-ATP6 là gen duy nhất bị đột biến gây NARP [66].

Trong các trường hợp của hội chứng Leigh, đa số các đột biến nằm trên gen MT-ATP6, đặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C. Sự biến đổi T thành G tại 8993 trong mtDNA người là một trong các đột biến ty thể kèm theo hội chứng Leigh được mô tả nhiều nhất. Đột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí 156 trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiểu đơn vị của tiểu phần F_o của phức hệ ATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [53].

Hội chứng Leigh còn liên quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn đến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124. ND5 là gen chức năng gồm 1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) được mã hóa bởi chuỗi nặng của mtDNA. Sản phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinon oxidoreductase. Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nước của phức hệ I. Protein này là một trong 7 tiểu phần được mã hóa bởi mtDNA trong số 42 tiểu phần của phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh trong đó có LHON, Leigh và MELAS [61].

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứng teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt. Bệnh thường phát triển ở tuổi trưởng thành, tỷ lệ ảnh hưởng của nam giới cao hơn 4 đến 5 lần so với nữ giới. Người mang bệnh ban đầu hoàn toàn không có biểu hiện cho đến giai đoạn phát triển thị giác làm mờ một mắt, mắt còn lại biểu hiện tương tự sau 2 - 3 tháng, khoảng 25% bệnh nhân khởi phát bệnh với 2 mắt ở cùng thời điểm. Thị lực giảm nghiêm trọng đến mức không thể đếm được ngón tay hoặc kém hơn nữa. Sau giai đoạn cấp tính, đĩa quang trở nên teo. Bất thường về thần kinh như run chân tay, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ và rối loạn vận động được báo cáo là thường gặp ở bệnh nhân LHON, ở nữ giới có thể phát triển triệu chứng đa xơ cứng [69].

Khoảng 95% trường hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50-70% trường hợp), đột biến G3460A trên gen ND1 (15% trường hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6 (10% trường hợp). Đột biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON. Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [3].

Các đột biến trên gen ND6 bao gồm T14484C, T14459C, các đột biến này không những gây ra các triệu chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứng Leigh. Đột biến G14453A cũng trên gen này, tác động lâm sàng phức tạp hơn, kèm theo các triệu chứng của LHON còn có các biểu hiện của MELAS.

LHON thường là do một đột biến mtDNA homoplasmy và các con sẽ kế thừa các đột biến từ mẹ. Tuy nhiên khoảng 50% nam giới sẽ biểu hiện bệnh, trong khi chỉ có 10% nữ giới bị mất thị giác. Sự tiến triển của bệnh phụ thuộc vào gen đột biến, 71% bệnh nhân đột biến T14484C có dấu hiệu phục hồi, trong khi đó ở bệnh nhân A11778G chỉ là 25%. Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến A11778G sớm khởi phát triệu chứng LHON, đã có một vài báo cáo về kiểu hình suy thoái thần kinh thị giác [69].

1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA

Bệnh do đột biến trên gen mã hóa rRNA chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Đột biến A1555G và C1494T được phát hiện trên gen mã hóa cho rRNA 12S, các đột biến này gây mất khả năng nghe do kích thích bởi aminoglycoside và mất khả năng nghe không có hội chứng. Trong đó, đột biến A1555G phổ biến hơn C1494T.

Đột biến A1555G là đột biến điểm mtDNA nằm trên gen MT-RNR1, quy dịnh sự tổng hợp 12S rRNA. Đột biến này nằm trên vị trí mã hóa tiểu đơn vị rRNA và được dự đoán gây ra một sự thay đổi trong cơ cấu thứ cấp của rRNA. Sự thay đổi này làm suy yếu tổng hợp protein và tăng cường tương tác với kháng sinh aminoglycoside, tiếp tục làm trầm trọng hơn tình trạng bệnh [2]. Đột biến đơn thuần thường không dẫn đến tình trạng bệnh lý, nhưng khi kết hợp với các yếu tố môi trường như kháng sinh nhóm aminoglycoside sẽ biểu hiện triệu chứng bệnh điển hình, thường quan sát được là mất thính lực ở các mức độ khác nhau. Đột biến A1555G thường ở dạng đồng nhất nhưng biểu hiện triệu chứng bệnh của các thành viên trong gia đình là rất khác nhau. Trong một nghiên cứu cũng chỉ ra rằng biểu hiện của bệnh chịu ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh amimoglycoside với 96,5% ở nhóm tuổi 30 điều trị kháng sinh và 39,9% với nhóm không điều trị kháng sinh [7].

Đột biến khác trên gen rRNA 12S là T1095C, gây nên sự thay đổi base bảo thủ ở vòng xoắn 25 của rRNA 12S. Nucleotide này nằm ở vị trí P của ribosome, có vai trò quan trọng trong giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp protein của ty thể. Sự thay đổi cấu trúc bậc ba của rRNA 12S làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein, vì vậy dẫn đến mất chức năng của ty thể và gây ra mất khả năng nghe.

1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA

Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) là bệnh liên quan đến sự phát triển sắc tố võng mạc và liệt cơ mắt ngoài tiến triển, thường khởi phát trước tuổi 20. Nguyên nhân là do mất đoạn mtDNA khoảng 2-4 kb, thường là 4997 bp từ vị trí 8488-13460, tại điểm đứt gãy thường có một đoạn 13 bp lặp lại. Ngoài những triệu chứng nhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, bệnh nhân thường có các biến chứng bao gồm thất điều tiểu não, suy giảm nhận thức và điếc, tắc nghẽn cơ tim, dáng người thấp bé, nuốt khó [56].

Hội chứng Pearson là một rối loạn hiếm gặp, thường khởi phát trong những năm đầu đời, đặc trưng bởi thiếu máu hồng cầu, tủy xương và suy tụy ngoại tiết. Diễn biến lâm sàng ở trẻ em có thể nặng dẫn đến tử vong sớm, những trường hợp sống sót thường có biểu hiện thiếu máu sau đó phát triển các đặc điểm lâm sàng của KSS. Bệnh thường được xác định là do mất đoạn mtDNA quy mô lớn, có mặt ở tất cả các mô [65].

Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external ophthalmoplegia- PEO) được đặc trưng bởi sự suy yếu của các cơ mắt, thường xuất hiện ở độ tuổi 18 - 40. Dấu hiệu phổ biến và khác so với bệnh liệt mắt tiến triển kinh niên (CPEO) như nhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ. Nguyên nhân gây bệnh là những khuyết tật trong ty thể, hay gặp ở các rối loạn mất đoạn mtDNA quy mô lớn, trong một số trường hợp là đột biến gen MT-TL1. Mặt khác, các đột biến gen nhân POLG, SLC25A4 và C10orf2 cũng là nguyên nhân gây nên bệnh này. Các nghiên cứu gần đây chưa chứng minh được sự tương quan giữa kích thước và vị trí đoạn mtDNA bị mất với mức độ biểu hiện của bệnh [54].

Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau do đột biến mất đoạn TTAA bắt đầu ở vị trí 14787 của gen CYTB. Bệnh nhân biểu hiện rối loạn tiến triển nặng, bắt đầu từ 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động. Sau này, bệnh nhân thể hiện hội chứng Parkinson, rung giật cơ và nhồi máu não [24].

Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xảy ra ở vùng không mã hóa nằm giữa gen mã cho cytochrome oxidase II (COII) và tRNA^Lys trong hệ gen ty thể. Vùng không mã hóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp từ vị trí 8272-8289 trên hệ gen ty thể. Hiện tượng mất đoạn 9 bp được xem là một dạng đột biến của hệ gen ty thể và có tỷ lệ cao ở các quần thể người châu Á bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam (20%), Thái Lan (29%) và Nhật Bản (20%) [62].

Đột biến mất đoạn xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản không được sửa chữa hoặc do quá trình sao chép bị lỗi. Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuất hiện như kết quả của một lỗi không được sửa chữa trong quá trình sao chép của mtDNA. Hiện tượng mất đoạn 9 bp được xem xét trên hai phương diện đó là nguồn gốc tiến hóa và mối liên quan giữa mất đoạn 9 bp với bệnh tật đặc biệt là các rối loạn ty thể.

Ngoài ra, một số bệnh ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn. Nghiên cứu đầu tiên về một đột biến đảo đoạn trong mtDNA gây bệnh cơ được phát hiện bởi Musumeci và tập thể vào năm 2000 [41]. Bệnh nhân được phát hiện mang đột biến đảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng 3902-3908 thuộc gen mã hóa cho ND1 của NADH ubiquinone oxidoreductase. Đột biến đảo đoạn này dẫn đến thay thế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) có tính bảo thủ cao trong chuỗi polypeptide, là đột biến ở dạng không đồng nhất 80% và được phát hiện trong cơ nhưng không có trong máu bệnh nhân. Sự thay đổi 3 acid amin liên tiếp từ Asp-Leu-Ala thành Gly-Lys-Val, liên quan đến một vùng bảo thủ cao của gen ND1 có vai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone.

3. 
   HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF)
   

Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên được mô tả. Sau đó các trường hợp khác tiếp tục được mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đã đưa ra các tính năng cơ bản của bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều được gọi là hội chứng MERRF. Bệnh nhân MERRF được chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ, động kinh, thất điều tiểu não, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách. Mặc dù đó là những biểu hiện chính nhưng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu được vận động, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc [15, 37].

Hội chứng lần đầu tiên được mô tả là do đột biến A8344G trên gen mã hóa cho tRNA^Lys của ty thể [13, 20, 42]. Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNA^Lys gây ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất. Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [9, 42]. MERRF cũng được mô tả ở bệnh nhân bị mất đoạn mtDNA. Các hội chứng gối nhau với đặc điểm MELAS/MERRF đã được báo cáo ở đột biến T7572C và T8356C trên tRNA^Ser [18].

1. 
   Các đột biến của hội chứng MERRF
   

1.3.1.1. Đột biến A8344G

Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80 - 90% số ca mang hội chứng MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK của ty thể làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNA^lys, do đó giảm khả năng tương tác với bề mặt ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng lysine vào protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi hô hấp trong ty thể. Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là các phức hợp I (NADH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase) [10, 20, 33].

Đột biến A8344G được di truyền độc lập từ mẹ sang con và thường tồn tại ở dạng không đồng nhất, nhưng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữa các cá thể và các mô trong cùng một cá thể [10]. Một nghiên cứu cho thấy rằng ở một phụ nữ có tỷ lệ bản sao ty thể mang đột biến A8344G trong cơ xương là 94%, trong máu là 38%, trong nước tiểu là 18%, còn mẹ của bệnh nhân có 16% gen đột biến trong máu và 18% trong nước tiểu, còn em gái có tỷ lệ đột biếntrong máu là 3% và trong nước tiểu là 4%. Định lượng được tỷ lệ gen đột biến nhằm xác định mức độ ảnh hưởng của bệnh đến cá thể mang đột biến. Tỷ lệ đột biến A8344G có tương quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy và thiếu cytochrome c oxidase, cũng như các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh hưởng nặng nề gợi ý rằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp protein của ty thể. Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hưởng bởi thiếu chuỗi hô hấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30].

Mặc dù được mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách nham nhở nhưng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất. Một nghiên cứu ở người phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng MERRF còn có nhiều triệu chứng khác như suy hô hấp và loạn dưỡng cơ. Một số trường hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận. Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh, rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30].

1.3.1.2. Đột biến T8356C

Hội chứng MERRF thường được biết đến với đột biến A8344G, nhưng không quan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu biểu của hội chứng MERRF. Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNA^lys của năm bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng được xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh), mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền sử gia đình tương thích với sự kế thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy tăng hàm lượng acid lactic, sinh thiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base được bảo tồn trong phân tử mtDNA gốc [51].

Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhưng sự phân bố của gen đột biến cũng rất khác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còn trong máu là 47%. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũng khá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc và đột quỵ giả tai biến giống như hội chứng MELAS [6].

1.3.1.3. Đột biến G8363A

Năm 1996, nhóm nghiên cứu Filippo M. Santorelli và cộng sự [45] đã sử dụng phương pháp phân tích đa dạng cấu hình DNA sợi đơn (SSCP) và giải trình tự trực tiếp của tất cả 22 gen tRNA mã hóa mtDNA để phát hiện tình trạng đột biến trong 9 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tương tự như hội chứng MERRF bao gồm tăng acid lactic và pyruvic trong máu, rối loạn thần kinh ngoại biên, thất điều não, giảm thính lực, sinh thiết cơ cho thấy các sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy cả 9 bệnh nhân trong 2 gia đình đều mang đột biến thay đổi nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtDNA. Phân tích RFLP cho thấy rằng đột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khác nhau như ở cơ là 95%, ở máu là 59 - 94% [49].

Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa (OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến G8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen tRNA^lys. Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hưởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp của tế bào, ảnh hưởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thường trong nguyên bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57].

Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính giác, nhiều u mỡ,... được chẩn đoán giống hội chứng Leigh.

2. 
   Những tác động của hội chứng MERRF trên người bệnh
   

Những đột biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, sử dụng oxy và sản xuất năng lượng. Những đột biến này ảnh hưởng đến các cơ quan và các mô với nhu cầu năng lượng cao như não và cơ. Bệnh thường biểu hiện trong các mô và dễ dàng phát hiện trong mtDNA từ bạch cầu trong máu [37]. Tuy nhiên, sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện ở các mô mang đột biến. Do đó những người có triệu chứng ít phù hợp với MERRF có thể không được phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các mô khác như nguyên bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng,... nhưng đáng tin cậy nhất là phát hiện từ các tế bào cơ xương [38].

Hội chứng MERRF thường được chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệu chứng tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch não tủy. Protein dịch não tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF. Kỹ thuật chụp ảnh não như hình ảnh cộng hưởng từ có thể tìm thấy các tổn thương như đột quỵ. Điện tâm đồ có thể được sử dụng để chẩn đoán bất thường về tim. Bảng 1.1 liệt kê các triệu chứng và dấu hiệu thấy được trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70]. Các đặc điểm lâm sàng thường gặp nhất có tỷ lệ tương ứng là: giật cơ, yếu cơ, mất điều hòa (35 - 45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0 - 34,9%); suy giảm nhận thức, nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0 - 24,9%); tăng CK, teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đường, đau cơ, run, và chứng đau nửa đầu (5,0 - 14,9%) [70].

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF [70]

Biểu hiện lâm sàng	Tần số xuất hiện	Tỷ lệ %
Giật cơ	62/62	100%
Động kinh	62/62	100%
Phát triển ban đầu bình thường	17/17	100%
Sợi cơ đỏ rách nham nhở	47/51	92%
Giảm thính lực	41/45	91%
Tăng acid lactic máu	24/29	83%
Tính kế thừa theo dòng mẹ	34/42	81%
Không dung nạp tập thể dục	8/10	80%
Mất trí	39/52	75%
Bệnh thần kinh	17/27	63%
Người thấp bé	4/7	57%
Giảm cảm giác	9/18	50%
Liệt dây thần kinh thị giác	14/36	39%
Bệnh cơ tim	2/6	33%
Hội chứng Wolff-Parkinson-White	2/9	22%
Bệnh võng mạc sắc tố	4/26	15%
U mỡ	2/60	3%

Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hưởng đến nhiều bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều trường hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng.

3. 
   Các phương pháp phát hiện đột biến MERRF
   

1. 
   Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP
   

Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA được phân cắt giới hạn. Phương pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự thay đổi về trình tự nucleotide của DNA dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DNA bị phân cắt có kích thước khác nhau, có thể nhận biết được dựa trên phổ băng khi điện di. Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DNA tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA khi được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tượng này đã tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel thì có thể phát hiện được các đột biến [25, 30, 45].

Kỹ thuật RFLP đã trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reation). PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu. DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu. Đây là một kỹ thuật rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng cũng có thể diễn ra.

Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể. PCR-RFLP là công cụ chẩn đoán sớm được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong mtDNA. Phương pháp này bao gồm các bước chính sau: (1) đoạn mtDNA chứa vị trí đột biến được khuếch đại nhờ các đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm PCR được phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DNA cắt được điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide không biến tính, nhuộm ethidium bromide (EtBr) và được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại. Việc lựa chọn enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDNA. Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến hoặc được chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định được đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt với enzyme.

Trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng, PCR-RFLP là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm gen ty thể. Đây là phương pháp đơn giản và hiệu quả để phát hiện đột biến mtDNA khi sàng lọc với số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy tương đối, đôi khi đột biến khó được phát hiện vì sự có mặt của các băng DNA mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ mtDNA đột biến trong mẫu thấp [26]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide là 5-10% [8].

2. 
   Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen
   

Kỹ thuật giải trình tự được sử dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến trong hệ gen ty thể. Xác định trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn loại đột biến trên DNA ty thể. Tuy vậy kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và chi phí cao, vì vậy nó thường được sử dụng để khẳng định chắc chắn sự có mặt của các đột biến trong đó có đột biến điểm mtDNA [10].

3. 
   Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism)
   

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Các cấu hình khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến trong phân tử mtDNA sẽ làm thay đổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách sợi DNA đột biến và không đột biến. Phương pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chưa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rối loạn mtDNA [12].

4. 
   Định lượng đột biến MERRF bằng phương pháp real-time PCR
   

Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đo tín hiệu huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị C_t (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mối quan hệ của mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đích ban đầu và mẫu nghiên cứu với giá trị chu kỳ ngưỡng [19, 52].

Ưu điểm chính của real-time PCR là cho phép xác định số bản sao ban đầu của mẫu DNA ở tỷ lệ thấp với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR có thể tính sự có mặt hay vắng mặt của alen hoặc định lượng số bản sao. Ngoài ra, lượng sản phẩm DNA đích có thể theo dõi được sau mỗi chu kỳ mà không cần kiểm tra bằng phương pháp điện đi [5, 8].

1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học

Biochip là một kỹ thuật mới, được sử dụng trong sàng lọc phát hiện các đột biến mtDNA, với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng vi tính.

Để sản xuất các chip DNA, các cặp mẫu dò được thiết kế đặc hiệu cho từng loại đột biến, bao gồm mẫu dò cho trình tự bình thường và mẫu dò cho trình tự đột biến. Mẫu dò được cài trên phiến kính một cách tự động, mỗi phiến kính với diện tích khoảng 1 cm² có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn mẫu dò khác nhau. DNA khuôn được đánh dấu và lai với các mẫu dò. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào DNA khuôn, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích [71].

Ở Việt Nam, một bệnh nhân MELAS mang đột biến A3243G đã được phát hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và tập thể [4] bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự nucleotide. Năm 2014, Trương Thi Huệ và tập thể [55] đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP sàng lọc 106 bệnh nhân cơ não tuy nhiên các tác giả không phát hiện được trường hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF. Như vậy đột biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã được nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có được còn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở người Việt Nam, đặc biệt là việc định lượng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến để đưa ra mối tương quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP

tải về 1.48 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: