Mô tả các bước tiến hành nghiên cứu

Trước khi tiến hành chọn mẫu, nghiên cứu viên đã làm việc với Sở Y tế Thái Nguyên, Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên để xin phép triển khai nghiên cứu. Sau khi được phép của Sở Y tế Thái Nguyên, nghiên cứu viên làm việc với Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên và huyện Phú Bình, cùng 8 trạm y tế xã để phổ biến nội dung, thống nhất về kế hoạch triển khai, đối tượng nghiên cứu, hình thức tổ chức triển khai.

Tiến hành thử nghiệm mẫu phiếu trước khi điều tra.

Tổ chức tập huấn điều tra viên về phương pháp thu thập số liệu kỹ thuật phỏng vấn, đo chiều cao, cân nặng, lấy mẫu xét nghiệm (máu, mẫu sữa) và kế hoạch tổ chức triển khai cho các điều tra viên trung ương.

- Lựa chọn cộng tác viên: mỗi thôn chọn một cộng tác viên (y tế thôn), tham gia nghiên cứu với tiêu chuẩn đủ sức khỏe, nhiệt tình và có trách nhiệm.

- Tập huấn cộng tác viên: về phân phát viên nang vitamin A và giả dược; hướng dẫn sử dụng; theo dõi các dấu hiệu bệnh tật và ghi chép sổ sách.

- Trách nhiệm của cộng tác viên: phụ trách 10 đối tượng ở cùng thôn với mình. Theo dõi đối tượng trong suốt thời gian nghiên cứu để trạm y tế xã, cập nhật và thông báo kịp thời cho nhóm nghiên cứu để bổ sung viên nang vitamin A hoặc giả dược đúng thời điểm yêu cầu; Theo dõi, phát hiện và ghi chép tình hình sức khỏe bà mẹ và các trường hợp trẻ bị tiêu chảy và nhiễm khuẩn hô hấp; Báo cáo với trạm y tế hoặc giám viên khi cần thiết; Chịu sự giám sát thường xuyên của trạm trưởng trạm y tế, nghiên cứu viên và các giám sát viên.

- Người chịu trách nhiệm giám sát chính trong quá trình can thiệp là nghiên cứu sinh. Bên cạnh đó có sự hỗ trợ của trạm trưởng trạm y tế các xã, cán bộ Trung tâm Y tế tỉnh Thái Nguyên, huyện Phú Bình và 2 cán bộ của khoa Vi chất dinh dưỡng.

- Nhiệm vụ của giám sát viên:

+ Giám sát thường xuyên các hoạt động của cộng tác viên: 1 tháng/lần giám sát viên đã họp với toàn bộ cộng tác viên, xem xét việc ghi chép sổ sách, nghe phản ánh về tình hình sử dụng viên thuốc bổ sung và tình hình bệnh tật.

+ Giám sát ngẫu nhiên ít nhất 10% đối tượng trẻ và bà mẹ trong diện can thiệp. Giám sát viên và cộng tác viên thăm gia đình đối tượng, phỏng vấn và đối chiếu lại các thông tin đã được ghi trong sổ. Nếu các thông tin không thống nhất, giám sát viên và cộng tác viên đã thảo luận, kiểm chứng và điều chỉnh thông tin phù hợp nhất.

2.2.4.5. Giai đoạn can thiệp: được tiến hành phụ thuộc vào thời điểm sinh bà mẹ

Nơi triển khai: Tại trạm y tế xã và hộ gia đình

Triển khai phân phát cho uống viên nang vitamin A và viên giả dược theo danh sách đối tượng của 2 nhóm nghiên cứu được chỉ định.

Tập huấn triển khai can thiệp cách vắt sữa bằng tay ở cộng đồng; cách sử dụng ống hút sữa; cách chuẩn bị đánh giá đáp ứng liều tương đối; Cách theo dõi bệnh tật, phản ứng phụ của các đối tượng theo biểu mẫu đã được thiết kế sẵn...

Tiến hành cho uống 1 liều vitamin A (200.000 đơn vị hoặc giả dược):

Việc cho uống viên nang vitamin A hoặc giả dược đã được thực hiện tại trạm y tế theo danh sách do cán bộ nghiên cứu của Viện Dnh dưỡng chuẩn bị. Tại thời điểm 1 tuần sau khi sinh và 6 tuần sau sinh các đối tượng đã được mời đến trạm y tế theo lịch hẹn, uống viên vitamin A/giả dược, ký tên vào sổ theo dõi uống vitamin A/ giả dược.

Các đối tượng thuộc nhóm nghiên cứu đã được theo dõi số lượng thuốc uống, ghi chép lại lượng uống được, ghi phản ánh về tác dụng phụ dưới sự giám sát và theo dõi của các cán bộ thuộc nhóm nghiên cứu.

Trong vòng 1 tuần đầu sau khi sinh (1 tuần + 3 ngày), phụ nữ đã nhận 1 viên nang (giả dược hoặc vitamin A phụ thuộc vào nhóm được phân chia). Tại các thời điểm này, mẫu sữa mẹ cũng được thu thập. Khoảng 6 tuần sau khi sinh (6 tuần + 2 tuần), bà mẹ đã được yêu cầu mang con đến trạm y tế để nhận 1 viên nang (vitamin A hoặc giả dược).

Ngoài ra, bà mẹ và trẻ cũng đã được yêu cầu quay trở lại trạm Y tế vào 6 tháng (+ 2 tuần) sau khi sinh. Mẫu máu mẹ và trẻ được thu thập để xác định tình trạng vitamin A (retinol huyết thanh), thiếu máu, protein pha nhiễm trùng cấp tính. Mẫu sữa mẹ, nhân trắc mẹ và trẻ cũng đồng thời được thu thập.

Thu thập mẫu xét nghiệm trong quá trình can thiệp

Mẫu sữa đã do cộng tác viên nghiên cứu (cán bộ nữ hộ sinh xã) đã được tập huấn và hướng dẫn thực hành thu thập theo lịch và sự hướng dẫn, giám sát của cán bộ Viện Dinh dưỡng và Trung tâm YTDP tỉnh, huyện.

Mẫu sữa mẹ đã được thu thập bằng cách lấy khoảng 20 ml sữa vào ống Facol từ 1 bên vú mà trẻ chưa bú ít nhất trong vòng 1,5-2 giờ. Sữa mẹ đã được vắt theo quy trình hướng dẫn đã được tập huấn cho nữ hộ sinh. Sau đó, mẫu sữa đã được tách vào 3 ống nhựa và được bảo quản trong hộp lạnh và vận chuyển tới Trung tâm Y tế Huyện cùng ngày để bảo quản -20^oC và vận chuyển về Viện Dinh dưỡng (2 tuần/lần) để bảo quản ở nhiệt độ -70^oC cho đến khi phân tích. Phân tích được tiến hành tại Viện Dinh dưỡng sau khi mẫu sữa được tan đá và trở về nhiệt độ phòng. Mẫu sữa được cho vào ống mao dẫn haematocrit, ly tâm bằng máy ly tâm hematocrit sau đó đọc kết quả trên thước chia vạch.

Việc theo dõi tuyển chọn đối tượng đã được tiến hành thường xuyên hàng tháng trong 16 tháng (tuyển chọn cho đến khi lấy đủ 380 PN có thai).

Để đánh giá hiệu quả của việc bổ sung viên nang vitamin A cho bà mẹ sau khi sinh, ảnh hưởng của thời điểm bổ sung và ảnh hưởng của phản ứng viêm, tiến hành điều tra đánh giá sau 6 tháng. Tại mỗi thời điểm nghiên cứu đã được đánh giá các chỉ số như sau:

Bảng 2.2. Các thông tin thu thập trong các thời điểm của nghiên cứu

+ Lấy máu xét nghiệm (3 lần): lần 1 (thời điểm đối tượng thai 26-30 tuần); lần 2 (đối tượng sau khi sinh trong khoảng 1 tuần ±3 ngày); lần 3 (đối tượng sau khi sinh trong khoảng 6 tháng ± 2 tuần); được lấy máu tĩnh mạch để xét nghiệm 2 chỉ số Hb, Retinol huyết thanh ở lần 1 và lần lấy máu 3; tỷ số MRDR lần 3 và xét nghiệm 3 chỉ số CRP, AGP, ACT ở tất cả các lần lấy máu.

+ Lấy mẫu sữa (2 lần): lần 1 (đối tượng sau khi sinh trong khoảng 1 tuần±3 ngày); lần 2 (đối tượng sau khi sinh trong khoảng 6 tháng ± 2 tuần) để xét nghiệm chỉ số retinol trong sữa mẹ.

- Đối với trẻ nhỏ là con của đối tượng nghiên cứu:

+ Lấy máu xét nghiệm (1 lần): lần 1 (trẻ khi sinh trong khoảng 6 ± 2 tuần); được lấy máu tĩnh mạch để xét nghiệm 2 chỉ số Hb, vitamin A huyết thanh, AGP, CRP và tỷ số MRDR

• 
  Kỹ thuật lấy máu: Đối tượng ở các nhóm tham gia nghiên cứu được lấy máu tĩnh mạch, mỗi lần lấy 3 ml máu tĩnh mạch đều vào buổi sáng từ 8 đến 11 giờ sáng. Máu sau khi lấy được bảo quản trong hộp lạnh, tránh ánh sáng, ly tâm sau 3 giờ, tốc độ 3000 vòng/phút. Các xét nghiệm được thực hiện tại labo Khoa Nghiên cứu vi chất dinh dưỡng – Viện Dinh dưỡng .
  

- Chỉ số Hemoglobin: 0,5 ml máu được cho vào ống nghiệm đã có chất chống đông bằng heparin lắc đều và bảo quản trong phích lạnh để định lượng Hb trong ngày. Hb được đánh giá bằng phương pháp cyanmethemoglobin.

- Chỉ số Retinol huyết thanh: 0,5 ml máu toàn phần được cho vào một ống nghiệm khác bảo quản ngay trong phích lạnh để tránh retinol huyết thanh không bị ôxy hoá bởi ánh sáng, ly tâm sau 3 giờ ở tốc độ 3000 vòng/phút để tách huyết thanh. Các mẫu huyết thanh được giữ ở nhiệt độ –80^oC cho đến khi được phân tích. Retinol huyết thanh được phân tích dựa vào phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPCL).

- Chỉ số đáp ứng liều tương đối (MRDR) phản ánh tình trạng dự trữ vitamin A trong gan. Cho uống 100 µg/kg trọng lượng cơ thể 3,4 didehydroretinyl acetate (DR) vào buổi sáng khi đói, sau đó ăn bữa ăn nhẹ. Lấy máu định lượng vitamin A sau khi uống 5 giờ, tính tỷ lệ nồng độ DR và retinol (R) huyết thanh. Tỷ lệ (R/DR = tỷ số MRDR) ≥0.06 được coi là dự trữ vitamin A trong gan thấp [77].

Cụ thể nghiên cứu tiến hành: 5 giờ trước khi lấy mẫu máu, bà mẹ (6 tháng sau khi sinh) và trẻ (6 tháng sau khi sinh) đã uống một liều nhỏ vitamin A dưới dạng 3,4-didehydroretinol, một dạng isomer tự nhiên của retinol, trong 0.5 ml dầu ngô (8,8 mol cho phụ nữ và 5 mol cho trẻ em). Định lượng hàm lượng retinol và 3,4-didehydroretinol trong huyết thanh đã được xác định bằng phương pháp HPLC (IVACG, 1982); Phân tích hàm lượng retinol và 3,4-didehydroretinol được thực hiện tại Labo Nghiên cứu Vi chất, Viện Dinh dưỡng.

2.2.5. Một số tiêu chuẩn xác định, đánh giá dùng trong nghiên cứu

2.2.5.1. Xác định tình trạng vitamin A

a). Dựa vào các chỉ số tiền lâm sàng

Vitamin A huyết thanh là chỉ số được sử dụng nhiều nhất trong đánh giá tình trạng VA. Tuy nhiên, xét nghiệm này chỉ có ý nghĩa tương đối vì hầu như toàn bộ vitamin A trong cơ thể được dự trữ ở gan, khi lượng dự trữ này đã giảm đáng kể thì nồng độ vitamin A huyết thanh vẫn chưa thay đổi nhiều nhờ cơ chế điều hòa.

> 0,7 µmol/l là tình trạng Retinol huyết thanh bình thường [3], [77].

Vitamin A huyết thanh trẻ và bà mẹ đã được phân tích tại labo vi chất bằng phương pháp HPLC. Bà mẹ và trẻ được coi là thiếu vitamin A tiền lâm sàng khi nồng độ vitamin A trong huyết thanh < 0,7 mol/L (WHO, 1996).

b). Đáp ứng liều tương đối uống bổ sung vitamin A (MRDR - modified relative dose-response)

Tỷ số hàm lượng 3,4-didehydroretinol/hàm lượng retinol (R/DR) (tỷ số MRDR ≥0,06) được xác định là thiếu dự trữ vitamin A trong gan [47], [78], [79].

Nồng độ trung bình vitamin A trong sữa là 1,75 - 2,45µmol/l; ngưỡng <1,05µmol/l được coi là thấp. Hàm lượng retinol trong sữa đã được phân tích theo phương pháp của Jackson và CS bằng phương pháp HPLC [80]. Đây là chỉ số phản ánh tình trạng vitamin A của cả mẹ và con. Nếu vitamin A trong sữa mẹ thấp, trẻ có thể bị coi là thiếu vitamin A ngay từ những tháng đầu [77],[81], [82].

Thiếu máu dinh dưỡng thường gặp nhất là thiếu máu do thiếu sắt, có thể kết hợp thiếu acid folic, nhất là trong thời kỳ có thai. Hàm lượng Hb trong máu thấp biểu hiện tình trạng thiếu máu ngoại vi. Thiếu máu thường chỉ phát hiện được khi kết hợp với tình trạng thiếu sắt nặng. Chẩn đoán thiếu máu thiếu sắt trong giai đoạn sớm dựa vào nồng độ Ferritin huyết thanh (SF) bằng phương pháp ELISA với chuẩn Ferritin huyết thanh.

Ở người lớn, hàm lượng SF lớn hơn 60 µg/l được coi là bình thường. Khi hàm lượng Ferritin huyết thanh nhỏ hơn 35 µg/l là tình trạng dự trữ sắt thấp; nhỏ hơn 15 µg/l là tình trạng dự trữ sắt huyết thanh đã cạn kiệt nặng [83], [84]. Định lượng Transferritin receptor ≥ 8,5 µg/l là thiếu sắt [85].

c). Ngưỡng phân loại đánh giá YNSKCĐ của thiếu máu

Theo TCYTTG, có thể đánh giá tình trạng thiếu máu trên cộng đồng dựa vào tỷ lệ thiếu máu [83]

Bảng 2. 5. Ngưỡng ý nghĩa sức khỏe cộng đồng theo tỷ lệ thiếu máu

Thu thập các thông tin về nhân khẩu học (bao gồm các thông tin về tuổi, giới, địa chỉ của trẻ tại thời điểm bắt đầu nghiên cứu (T₀) bằng phiếu phỏng vấn bà mẹ.

Chi tiết ở phụ lục 1 kèm theo

• 
  Nhân trắc (Cân nặng trung bình, chiều cao trung bình)
  
• 
  Tỷ lệ cân nặng thấp ≤ 45kg; chiều cao thấp < 145 cm
  
• 
  Tỷ lệ thiếu năng lượng trường diễn trước mang thai
  
• 
  Chỉ số BMI trước khi mang thai
  
• 
  Số kg tăng và mức tăng cân trước, trong khi mang thai
  

• 
  Tỷ lệ VAD-TLS, nguy cơ thiếu VA-TLS
  
• 
  Hàm lượng vitamin A huyết thanh trung bình
  
• 
  Tỷ lệ thiếu vitamin A tiền lâm sàng theo nhóm tuổi
  

• 
  Tỷ lệ thiếu máu chung, thiếu máu theo nhóm tuổi
  
• 
  Mức độ thiếu máu
  
• 
  Hàm lượng Hb trung bình
  

• 
  Hàm lượng vitamin A huyết thanh trung bình của bà mẹ và trẻ
  
• 
  Tỷ lệ VAD-TLS mẹ và trẻ; dự trữ vitamin A trong gan thấp mẹ và trẻ; vitamin A sữa mẹ thấp
  
• 
  Hàm lượng vitamin A sữa mẹ trung bình
  
• 
  Tỷ số MRDR trung bình mẹ và trẻ HPLC
  
• 
  Hàm lượng CRP, AGP sử dụng hiệu chỉnh hàm lượng vitamin A
  

• 
  Tỷ lệ thiếu máu mẹ và trẻ
  
• 
  Hàm lượng Hb trung bình mẹ và trẻ và ferritin, transferritin mẹ
  
• 
  Tỷ lệ dự trữ sắt và thiếu sắt mẹ
  

• 
  Nhân trắc (Cân nặng trẻ và mẹ; chiều dài nằm trẻ và chiều cao mẹ)
  
• 
  Chỉ số Z-score CN/T, CN/CC và CC/T của trẻ
  
• 
  Tỷ lệ SDD trẻ các thể
  

- Tỷ lệ phần trăm dân tộc, trình độ học vấn, nghề nghiệp, kinh tế, tình trạng hôn nhân, số con, số lần bú mẹ

- Tỷ lệ phần trăm thiếu vitamin A, mức độ thiếu, giá trị trung bình của hàm lượng vitamin A huyết thanh

- Tỷ lệ phần trăm thiếu máu, mức độ thiếu máu, giá trị trung bình của hàm lượng Hb

Qui trình làm sạch: các phiếu phỏng vấn được kiểm tra trước khi nhập liệu và sau khi nhập liệu.

Phương pháp phân tích số liệu: sử dụng phần mềm Epi Data để nhập liệu và phần mềm SPSS 18.0 để phân tích. Số liệu về nhân trắc học xử lý bằng phần mềm Anthro WHO, 2006. Số liệu đã được kiểm tra kỹ lưỡng về sự sai số, tính đồng nhất và sai số đã được sửa đổi (nếu có) bằng so sánh tất cả các bản ghi liên quan của cùng một đối tượng.

Trước khi phân tích, các số liệu đã được kiểm tra phân bố chuẩn, với những biến số không phân bố chuẩn, sử dụng phép biến đổi log để hiệu chỉnh. Test thống kê được sử dụng với giá trị p<0,05 được coi là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê là:

+ Test khi bình phương (² test) đã được sử dụng để xác định sự khác biệt về tỷ lệ với khoảng tin cậy 95%CI. Số liệu đã được trình bày ở dạng số và tỷ lệ phần trăm (thiếu máu, thiếu VA-TLS, dự trữ vitamin A trong gan thấp.. )

+ Kiểm định ANOVA một chiều và T-test với biến liên tục, độc lập và có phân bố chuẩn. Biến liên tục được trình bày ở dạng TB ± SD. Sự khác biệt trung bình của các biến liên tục (hàm lượng vitamin A trong sữa mẹ, trong huyết thanh bà mẹ và trẻ, tỷ số MRDR, Hb), giữa các nhóm tại thời điểm điều tra. Kiểm định Mann Whisney U với biến liên tục không phân bố chuẩn (sắt huyết thanh ...); Tương quan tuyến tính (Pearson test) để kiểm định tương quan tuyến tính giữa các biến liên tục; Hồi qui logistic dự đoán các yếu tố liên quan có kiểm soát các yếu tố nhiễu.

Phân tích số liệu đã được tiến hành tại thời điểm điều tra ban đầu, sau 1 tuần và sau 6 tháng. So sánh giữa các nhóm về các chỉ số nhân trắc, sinh hoá. Phân tích số liệu được tiến hành khi các đối tượng uống đủ liều thuốc, các mẫu xét nghiệm được lấy theo quy định.

2.2.8. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

Đối tượng đã được giải thích rõ về mục đích, nội dung và quyền lợi khi tham gia , đồng thời ký giấy tình nguyện tham gia. Những thông tin cá nhân về đối tượng được mã hoá và giữ kín. Các số liệu thu thập được trong quá trình nghiên cứu được mã hoá, và chỉ được nghiên cứu viên sử dụng cho mục tiêu nghiên cứu, không phục vụ cho mục đích nào khác

Trong quá trình can thiệp thử nghiệm đối tượng có quyền quyết định ngừng tham gia hoặc không trả lời ở bất kỳ thời điểm nào. Những đối tượng tham gia đã được tư vấn về chăm sóc dinh dưỡng và sức khoẻ. Đối tượng tham gia nghiên cứu đã được nhận tiền bồi dưỡng hoặc quà cho từng giai đoạn.

Phương pháp lấy máu và kỹ thuật xét nghiệm máu đã được chuẩn hóa. Kỹ thuật viên lấy máu là người đã được tập huấn và có kỹ năng tốt. Dụng cụ lấy máu cho các đối tượng đều đảm bảo an toàn tuyệt đối theo đúng qui định và chỉ sử dụng 1 lần. Kết quả xét nghiệm máu của điều tra được thông báo cho các đối tượng và phòng y tế sau khi kết thúc nghiên cứu. Phụ nữ có hàm lượng Hb <70 g/l tại thời điểm điểu tra được loại ra khỏi nghiên cứu và gửi cho bệnh viện Huyện để điều trị. Đối tượng bị thiếu máu đã được cán bộ y tế hướng dẫn chế độ điều trị và DD hợp lý. Nghiên cứu đã được thông qua bởi Hội đồng khoa học, Hội đồng đạo đức của Viện Dinh dưỡng trước khi triển khai theo quyết định số 813/QĐ-VDD ngày 16/11/2010.

2.2.9. Các biện pháp khống chế sai số

Các xét nghiệm sinh hoá tuân thủ quy trình lấy mẫu, quá trình bảo quản mẫu tránh ánh sáng, lạnh (cho retinol) tránh ô nhiễm vi chất từ bên ngoài, các phép đo đều được phân tích bằng phương pháp chuẩn cập nhật, có kiểm tra chất lượng của WHO, các tổ chức (IVACG, CDC-US).

Các số liệu nhân trắc: sử dụng điều tra viên cố định tham gia cân, đo từ đầu đến cuối nghiên cứu, bằng cùng loại cân thước, cùng thời điểm. Sử dụng các công cụ chuẩn (cân, thước), sử dụng kỹ thuật chuẩn xác, thực hiện đúng theo thường quy và thống nhất phương pháp điều tra trong tất cả điều tra viên để tránh sai số do người đo và dụng cụ.

Số liệu bệnh tật: cộng tác viên được tập huấn cách ghi chép, cách thức theo dõi đối tượng trạm trưởng y tế của các xã và nghiên cứu viên kiểm tra lại các ghi chép hàng tuần.

Số liệu được làm sạch trước khi nhập máy tính, nhập 2 lần, phân tích tầng, ghép cặp trong xử lý số liệu để khống chế nhiễu và sai số.

2.2.10. Hạn chế của nghiên cứu

Nghiên cứu thuộc khuôn khổ hợp tác giữa Viện Dinh dưỡng và tổ chức Nghiên cứu và phát triển Pháp (IRD), các chỉ số về tình trạng vitamin A cần hiệu chỉnh tương ứng với tình trạng nhiễm trùng dưới sự hỗ trợ của thày hướng dẫn Tiến sĩ Frank Weiringa đã chuyển công tác sang nước khác, do vậy cần rất nhiều thời gian trao đổi, xin ‎ý kiến và được sự thông qua của các thày hướng dẫn nên luận văn được hoàn thành trễ hơn dự kiến.

Nghiên cứu đã không theo dõi theo từng giai đoạn sau sinh về thực hành nuôi con bằng sữa mẹ, mà chỉ có số liệu điều tra ở thời điểm 6 tháng nên việc không có số liệu về tỷ lệ nuôi con bằng sữa mẹ của trẻ từ 0 – 6 tháng tuổi để phân tích sâu hơn về khía cạnh này.

Có rất nhiều chỉ số mẫu thu thập ở cặp mẹ, con trong thời điểm sau sinh 6 tháng, trên cỡ mẫu lớn số do vậy gặp cũng khó khăn trong quá trình thu thập số liệu, mẫu thu thập không đều ở các chỉ số.