2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng
Tạo huyền dịch vi khuẩn thuần nhất, chuẩn bị DNA của vi khuẩn S. suis làm chứng dương và tạo mô hình thử nghiệm.
2.2.1.1. Khẳng định các đặc tính của vi khuẩn tạo mẫu:
Cấy mới
Cấy từ ống giữ chủng (cất ở -800C) lên môi trường thạch máu 5%, ủ qua đêm ở 370C/5%CO2. Nhận xét hình thái khuẩn lạc, tính gây tan huyết.
Tính chất bắt màu Gram
Nhuộm Gram được thực hiện như sau:
-
Làm sạch phiến kính bằng lau cồn và hơ qua lửa đèn cồn, để nguội;
-
Nhỏ 01 giọt PBS hoặc nước muối sinh lý lên phiến kính;
-
Lấy 1 khuẩn lạc, hòa đều khuẩn lạc vào trong giọt PBS (hoặc nước muối sinh lý), dùng que cấy dàn rộng và để khô tự nhiên;
Chú ý: các bước này thực hiện trong tủ an toàn sinh học
-
Cố định tế bào vi khuẩn trên phiến kính bằng hơ qua trên lửa đèn cồn hoặc bằng methanol;
-
Phủ 1 giọt thuốc nhuộm Crystal Violet lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nước;
-
Phủ 1 giọt ‘Stabilized Gram Iodine’ hoặc dung dịch 2% Iodide lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nước;
-
Để tẩy màu, ngâm tiêu bản vào dung dịch ‘Gram Decolorizer’ (250ml Acetone + 750ml Isopropanol) hoặc dung dịch Acetone/Ethanol (50%/50%), sau đó rửa phiến kính bằng nước máy;
-
Phủ tiếp 1 giọt dung dịch ‘Gram Safranin Counterstain’ hoặc dung dịch 0.1% Fucsin lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nước;
-
Tiêu bản được để khô tự nhiên. Trước khi soi đặt một lá kính lên phần tiêu bản đã nhuộm và soi dưới kinh hiển vi quang học có vật kính 100x .
Phản ứng catalase:
-
Pha dung dịch 3% H2O2 với nước cất trước khi thực hiện phản ứng;
-
Dùng que cấy lấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn (thường lấy ở tâm khuẩn lạc) đặt lên phiến kính. Không lấy lẫn thạch máu vào mẫu vi khuẩn;
-
Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% vào vùng có khuẩn lạc trên phiến kính;
-
Quan sát sự nổi bong bóng (sinh khí);
Lưu ý: toàn bộ quá trình thử nghiệm phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học
Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield
-
Cấy mới chủng vi khuẩn cần thử trên thạch máu cừu, ủ qua đêm ở 35-37oC có hoặc không có CO2;
-
Pha enzym tách chiết (extraction enzyme solution): trộn 11ml nước tinh khiết vào lọ enzym (Streptex), hoà tan. Dung dịch enzym này có thể giữ ở 2-8oC trong 3 tháng. Muốn giữ lâu hơn, chia nhỏ thể tích và giữ ở -200C;
-
Thực hiện phản ứng ngưng kết tiếp theo trong tủ an toàn sinh học:
-
Nhỏ 1400 µl dung dịch enzym tách chiết (Extraction Enzyme solution) vào ống Epp đã đánh dấu (dung lượng 1,5ml). Hoà chủng vi khuẩn cần thử nghiệm vào dung dịch enzyme này (khoảng 5 khuẩn lạc to);
-
Ủ huyền dịch vi khuẩn/enzym ở 35- 37℃ trong 1 giờ;
-
Ly tâm ở 13000-15000 rpm trong 30’’(sec). Dịch nổi được thu hồi cho phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh xác định nhóm (dạng ngưng kết latex);
-
Trộn kỹ các lọ thuốc thử latex bằng vortex. Nhỏ 01 giọt (khoảng 20µl của mỗi loại huyền dịch latex (Streptex) lên vòng tròn của tấm thẻ phản ứng;
-
Đặt 1 giọt (khoảng 10 µl huyền dịch vi khuẩn (sau bước 3) vào thẻ phản ứng. Trộn đều và dàn rộng để quan sát hiện tượng ngưng kết.
-
Xoay tấm thẻ lên xuống và quan sát phản ứng ngưng kết bằng mắt thường;
-
Ghi nhận kết quả: chủng S. suis được thử thuộc nhóm D.
Xác định tính chất sinh học
-
Vi khuẩn S. suis được xác định tính chất sinh học bằng bộ API 20 Strep (BioMérieux);
-
Tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục tương đương 1Mc Farland với nước muối sinh lý;
-
Nhỏ lên lam kính sạch 15µl kháng huyết thanh kháng S. suis typ 2;
-
Nhỏ 15 µl nước muối sinh lý lên 1 vị trí khác trên lam kính;
-
Nhỏ vào mỗi vi trí trên 15µl huyền dịch vi khuẩn;
-
Trộn đều bằng tăm gỗ, quan sát sự ngưng kết trong vòng 1 phút:
-
Phản ứng (+): xuất hiện các hạt nhỏ và hỗn dịch trở nên trong ở vị trí có kháng huyết thanh; vẫn đục đều ở vị trí có nước muối sinh lý;
-
Phản ứng (-): hỗn dịch vẫn đục đều.
2.2.1.2. Nghiên cứu tạo mô hình bệnh phẩm với vi khuẩn S. suis: -
Chọn 10 mẫu DNT của những bệnh nhân viêm não vi rút hoặc hội chứng não cấp (được khẳng định không phải viêm màng não do vi khuẩn), hỗn hợp lại (đây là dịch não tủy nền)
-
Gặt vi khuẩn S. suis (đã được cấy mới và kiểm tra ở trên) từ môi trường thạch máu 5% pha vào 1ml hỗn hợp dịch não tủy đã chuẩn bị ở trên.
-
Điều chỉnh độ đục ngang với thang chuẩn 0,5 Mc Farland.Tính lại số vi khuẩn/ml (vì theo quy định của bộ so độ đục Mc Farland thì 1,5 x 108 tương đương độ đục 0,5 Mc Farland, thực tế đối với vi khuẩn S. suis sẽ là bao nhiêu ở độ đục 0,5 Mc Farland?) bằng cách pha loãng tiếp bậc 10, lấy 1ml ở nồng độ pha loãng thấp nhất (thường tương đương 102/ml) láng đều lên đĩa thạch máu 5%, Ủ qua đêm và đếm số khuẩn lạc. Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn S. suis tương đương là 1,21 x 107 vk/ µl
-
Từ canh khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland, sẽ thực hiện 2 việc:
-
Chia nhỏ thể tích huyền dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf (0,1ml/1ống): để thực hiện mục đích“Xây dựng phương pháp xử lý dịch não tủy đơn giản không dùng kit và đảm bảo hiệu quả”
Pha các nồng độ vi khuẩn hơn kém nhau 10 lần như sau:
-
Hỗn dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland có lượng vi khuẩn tương đương 107 vk/µl (1).
-
Để có nồng độ 106vk/ µl: 10 µl của (1) + 90 µl DNT (2)
-
Để có nồng độ 105vk/ µl: lấy 10 µl của (2) + 90 µl DNT (3)
-
Để có nồng độ 104vk/ µl: lấy 10 µl của (3) + 90 µl DNT (4)
-
Để có nồng độ 103vk/ µl: lấy 10 µl của (4) + 90 µl DNT (5)
-
Để có nồng độ 102vk/ µl: lấy 10 µl của (5) + 90 µl DNT (6)
-
Để có nồng độ 10vk/ µl: lấy 10 µl của (6) + 90 µl DNT (7)
-
Để có nồng độ 1vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 90 µl DNT (8)
-
Để có nồng độ 5 vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 10 µl DNT (9)
-
Để có nồng độ 2 vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 40 µl DNT (10)
Những nồng độ vi khuẩn còn nguyên vẹn này được sử dụng để nghiên cứu xây dựng, tối ưu quy trình PCR đa mồi và kỹ thuật tách chiết DNA đơn giản bằng nhiệt độ, không sử dụng kit tách chiết (là thương phẩm) và đánh giá kết quả phát hiện trực tiếp vi khuẩn từ DNT bằng PCR.
-
Sử dụng 0,5ml hỗn dịch để tách DNA bằng bộ sinh phẩm ‘High Pure PCR product purification’ và enzyme mutanolysin. Sau đó đo lượng DNA thu được bằng máy đo “DNA Nano drop” và pha thành các nồng độ nhỏ hơn nhau 10 lần (pha loãng bậc 10) với dịch não tủy nền: loạt nồng độ này sử dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trình PCR đa mồi.
Chi tiết của bước ‘Tách chiết và tinh sạch DNA của vi khuẩn S. suis – đo nồng độ DNA': -
Từ chủng vi khuẩn S. suis gây bệnh đã qua các bước kiểm tra chất lượng ở trên được cấy mới trên môi trường thạch máu 5%.
-
Chuẩn độ vi khuẩn theo độ đục 0,5 Mc Farland (trong DNT).
-
Lấy 0,5ml hỗn dịch vi khuẩn có độ đục trên, ly tâm 14.500 vòng/15 phút, lấy cặn bỏ dịch nổi.
-
Ủ cặn với 90µl đệm Tris (10mM, pH 8,0) và 10 µl Mutanolysin (1mg/ml) ở 370C/20 phút.
-
Sau đó thực hiện theo hướng dẫn của Nhà sản xuất Roche “High Pure PCR product purification Kit” (Roche Diagnostics, Cat. 11732676001).
-
Trộn 500 µl Binding Buffer với hỗn dịch (4), đặt hỗn hợp vào ống lọc (Filter) được hứng phía dưới bởi 1 ống dung tích 2ml, ly tâm 14500 x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
-
Chuyển ống Filter sang ống 2ml mới, cho tiếp 500 µl Washing Buffer vào Filter (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
-
Chuyển ống Filter sang ống 2ml mới, cho tiếp 200 µl Washing Buffer vào Filter (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
-
Chuyển ống Filter sang ống Eppendorf 1,5ml mới, viết tên/mã số bệnh phẩm lên nắp (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), cho 50 µl Tris buffer (10mM, pH 8.0) vào ống Filter, đóng chặt nắp và đặt cả bộ vào máy Ủ NHIỆT 700C/10 phút. Sau khi “ủ nhiệt” ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
-
Loại bỏ ống Filter, giữ lại ống Epp đã chứa dịch được đẩy xuống (đó là DNA đã được tách chiết & tinh sạch). Bảo quản ở - 200C và sử dụng 0,5 - 1 µl làm khuôn đích DNA
-
Đo nồng độ DNA đã tinh sạch bằng máy quang phổ đo DNA. Tính số lượng vi khuẩn dựa trên trọng lượng phân tử (DNA) của vi khuẩn.
Cách tính: hàm lượng DNA của vi khuẩn trong huyền dịch vi khuẩn thuần nhất sau khi tách chiết bằng Kit (bộ sinh phẩm thương mại):
46.71 µg/ml (= 4,67 x 10-8g/µl).
Kích thước bộ gen của S. suis là: 2Mb = 2 x 106 (bp)
Trọng lượng phân tử là: 2 x 106 x 660 = 1,32 x 109 dalton
Vì vậy, số copy (hay số vi khuẩn) trong 1µl của huyền dịch tạo được là:
(4,67 x 10-8 x 6,023 x 1023 ) x 1
---------------------------------------- = 2,13 x 107 copy/µl (1)
1,32 x 109
-
Để có nồng độ 106 copy / µl: lấy 10 µl của (1) + 90 µl DNT (2)
-
Để có nồng độ 105 copy / µl: lấy 10 µl của (2) + 90 µl DNT (3)
-
Để có nồng độ 104 copy / µl: lấy 10 µl của (3) + 90 µl DNT (4)
-
Để có nồng độ 103 copy / µl: lấy 10 µl của (4) + 90 µl DNT (5)
-
Để có nồng độ 102 copy /µl: lấy 10 µl của (5) + 90 µl DNT (6)
-
Để có nồng độ 101 copy / µl: lấy 10 µl của (6) + 90 µl DNT (7)
-
Để có nồng độ 100(1 copy)/µl: lấy 10 µl của (7) + 90 µl DNT (8)
-
Để có nồng độ 5 copy/µl: lấy 10 µl của (7) + 10 µl DNT (9)
-
Để có nồng độ 2 copy /µl: lấy 10 µl của (7) + 40 µl DNT (10)
Những nồng độ DNA này được sử dụng trong thực nghiệm đánh giá hiệu quả phát hiện của PCR đa mồi:
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn
Yêu cầu về tổ hợp mồi:
-
Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ít nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau luôn phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis
-
Kích thước sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt được
-
Có cùng nhiệt độ bắt cặp
-
Khả năng cạnh tranh thấp
-
Đạt độ nhạy và đặc hiệu
Thực hiện theo yêu cầu trên, cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi tổ hợp mồi bao gồm 1 cặp đặc hiệu cho S. suis + 1 cặp đặc hiệu cho typ huyết thanh 2 + 1 cặp đặc hiệu cho Suilysin/ hoặc 1,2 yếu tố độc lực phổ biến khác.
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm
Tổ hợp
|
Các loại mồiMồi mã hóa
|
Đặc hiệu cho S. suis
|
Typ huyết thanh 2
|
Enzym ly giải
tế bào
|
Enzym khác
|
Protein ngoại bào
|
Tổ hợp 1
|
16S rDNA
|
Cps2J
|
Sly
|
-
|
-
|
Tổ hợp 2
|
16S rDNA
|
Cps2J
|
Sly
|
arcA
|
-
|
Tổ hợp 3
|
16S rDNA
|
Cps2J
|
Sly
|
-
|
Mrp
|
Tổ hợp 4
|
16SrDNA
|
Cps2J
|
Sly
|
arcA
|
Mrp
|
Tổ hợp 5
|
Gdh
|
Cps2J
|
Sly
|
-
|
-
|
Tổ hợp 6
|
Gdh
|
Cps2J
|
Sly
|
arcA
|
-
|
Tổ hợp 7
|
Gdh
|
Cps2J
|
Sly
|
-
|
Mrp
|
Tổ hợp 8
|
Gdh
|
Cps2J
|
Sly
|
arcA
|
Mrp
|
Tổ hợp 9
|
Strep2
|
Cps2J
|
Sly
|
-
|
-
|
Tổ hợp 10
|
Strep2
|
Cps2J
|
Sly
|
arcA
|
-
|
Tổ hợp 11
|
Strep2
|
Cps2J
|
Sly
|
-
|
Mrp
|
Tổ hợp 12
|
Strep2
|
Cps2J
|
Sly
|
arcA
|
mrp
|
Tổ hợp 13
|
16S rDNA
|
Cps2JJ
|
Sly
|
-
|
-
|
Tổ hợp 14
|
16S rDNA
|
Cps2JJ
|
Sly
|
arcA
|
-
|
Tổ hợp 15
|
16S rDNA
|
Cps2JJ
|
Sly
|
-
|
Mrp
|
Tổ hợp 16
|
16SrDNA
|
Cps2JJ
|
Sly
|
arcA
|
Mrp
|
Tổ hợp 17
|
Gdh
|
Cps2JJ
|
Sly
|
-
|
-
|
Tổ hợp 18
|
Gdh
|
Cps2JJ
|
Sly
|
arcA
|
-
|
Tổ hợp 19
|
Gdh
|
Cps2JJ
|
Sly
|
-
|
Mrp
|
Tổ hợp 20
|
Gdh
|
Cps2JJ
|
Sly
|
arcA
|
Mrp
|
Tổ hợp 21
|
Strep2
|
Cps2JJ
|
Sly
|
-
|
-
|
Tổ hợp 22
|
Strep2
|
Cps2JJ
|
Sly
|
arcA
|
-
|
Tổ hợp 23
|
Strep2
|
Cps2JJ
|
Sly
|
-
|
Mrp
|
Tổ hợp 24
|
Strep2
|
Cps2JJ
|
Sly
|
arcA
|
Mrp
|
Kỹ thuật sử dụng để đánh giá:
-
Kỹ thuật PCR thông thường (đơn mồi và đa mồi được xây dựng trong đề tài)
-
Kỹ thuật điện di
-
Sử dụng thạch điện di Nusieve GTG Agarose và ‘Seakem GTG Agarose’ pha tỷ lệ 1/1 (2%) ; 1,5/1 (2,5%) và 2/1 (3%) trong đệm điện di (TAE hoặc TBE).
-
Pha mẫu điện di : 2µl Loading buffer + 8µl sản phẩm PCR (1 giếng)
-
Chạy điện di ở điện thế 100V /30 phút.
-
Nhuộm sản phẩm điện di bằng Red Safe.
2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt
Thực nghiệm thay đổi các điều kiện về nhiệt độ biến tính, thời gian biến tính, nhiệt độ bắt cặp, thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài, số chu kỳ, bổ sung thêm chu trình nhiệt phụ... để chọn ra chương trình PCR đa mồi thích hợp với mục tiêu “phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến”
Kỹ thuật sử dụng trong suốt nghiên cứu là PCR với các chương trình nhiệt thay đổi để lựa chọn những điều kiện cho hiệu quả cao nhất.
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm
TT
|
Giai đoạn đầu
|
Giai đoạn chính
|
Giai đoạn sau cùng
|
Ghi chú
|
1
|
960C (3’)
|
940C (30”); 550C (30”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
Thêm giai đoạn nhiệt độ cao lúc khởi đầu
|
2
|
960C (3’)
|
940C (30”);550C (30”);
720C (1’)40 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT1+Tăng số chu kỳ chính
|
3
|
960C (3’)
|
940C (30”);550C (30”);
720C (1’); 35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT1+Tăng thời gian bắt cặp
|
4
|
960C (3’)
|
940C (30”);550C (60”);
720C (1’); 40 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT1+Tăng số chu kỳ chính + Tăng thời gian bắt cặp
|
5
|
960C (3’)
|
940C (30”); 550C (30”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (10’)
|
CT1 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng
|
6
|
960C (3’)
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT1 + tăng nhiệt độ bắt cặp
|
7
|
960C (3’)
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’)40 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT2 + tăng nhiệt độ bắt cặp
|
8
|
960C (3’)
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’); 35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT3 + tăng nhiệt độ bắt cặp
|
9
|
960C (3’)
|
940C (30”); 600C (60”);
720C (1’); 40 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT4 + tăng nhiệt độ bắt cặp
|
10
|
960C (3’)
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (10’)
|
CT5 + tăng nhiệt độ bắt cặp
|
11
|
950C (3’); 600C (30”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT phụ + CK8
|
12
|
950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT11+Tăng thời gian bắt cặp của chu trình phụ
|
13
|
950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (60”);
720C (1’);35 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT12+ Tăng thời gian bắt cặp của chu trình chính
|
14
|
950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (60”);
720C (1’);40 chu kỳ
|
720C (5’)
|
CT 13 + Tăng thêm chu kỳ chính
|
15
|
950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (60”);
720C (1’);40 chu kỳ
|
720C (7’)
|
CT14 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng
|
16
|
960C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (60”);
720C (1’);40 chu kỳ
|
720C (7’)
|
CT15 + Tăng nhiệt độ chu trình phụ
|
17
|
960C (3’); 600C (30”); 720C (1’), 3 chu kỳ
|
940C (30”); 600C (30”);
720C (1’);40 chu kỳ
|
720C (7’)
|
CT16 + Giảm thời gian bắt cặp
|
2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia phản ứng
Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng các chất tham gia phản ứng và một số chất có thể gây ức chế phản ứng PCR có mặt trong mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (các dNTP, Taq polymerase, muối MgCl2, NaCl, chất xử lý nhày...): thay đổi hàm lượng, đánh giá bằng PCR đa mồi đã được tối ưu điều kiện ở trên.
Lựa chọn thạch điện di và nồng độ thạch điện di để đảm bảo phát hiện sản phẩm PCR đa mồi.
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. -
Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một dải nồng độ từ 106 đến 1 copy/µl (là sản phẩm của 2. 2. 1)
-
Sử dụng tổ hợp mồi (là sản phẩm của 2.2. 2)
-
Sử dụng chương trình PCR đa mồi được xây dựng (là sản phẩm của 2. 2. 3)
-
Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ưu ((là sản phẩm của 2. 2. 4)
-
Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di.
-
Phản ứng được lặp lại 10 lần để đánh giá khả năng bền vững và ổn định của phương pháp phát hiện bằng PCR đa mồi.
2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis
Những trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu này đều là những trình tự tham khảo từ những bài báo Khoa học đăng trên các tạp chí uy tín, nên tính đặc hiệu của những cặp mồi này đã được khẳng định. Tuy nhiên, chúng tôi cũng vẫn sử dụng một số chủng vi khuẩn thường gây bệnh viêm màng não mủ giống S. suis hoặc có đặc điểm cấu tạo giống S. suis (có vỏ polysaccarit, có enzyme ly giải....) để kiểm tra, đánh giá thêm tính đặc hiệu của trình tự mồi cũng như của quy trình phản ứng PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài.
-
Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một nồng độ, chọn nồng độ 106 vk/µl.
-
Sử dụng tổ hợp mồi được lựa chọn
-
Sử dụng chương trình PCR đa mồi tối ưu được xây dựng
-
Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ưu
-
Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên thạch agarose.
-
Phản ứng được thực hiện với mẫu tế bào đích của từng loại vi khuẩn khác nhau nhưng gây bệnh cảnh lâm sàng viêm màng não mủ giống S. suis hoặc có đặc điểm cấu tạo giống S. suis và của bạch cầu người để kiểm tra sự không bắt cặp chéo (đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng phát hiện vi khuẩn và đặc tính vi khuẩn S. suis).
2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis
Từ huyền dịch vi khuẩn S. suis thuần khiết đã được chuẩn độ ở trên, chúng tôi nghiên cứu các phương pháp tách chiết đơn giản DNA của vi khuẩn trực tiếp trong bệnh phẩm và đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của S. suis bằng thực nghiệm phát hiện bởi PCR đa mồi được xây dựng dành cho vi khuẩn S. suis như sau:
2.2.7.1. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt độ có kết hợp enzyme (hỗ trợ phá vỡ tế bào):
Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hình là ‘DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ’):
-
Lấy 100µl vào ống Eppendorf + lysozym (nồng độ cuối 2mg/ml), ủ ở các thời gian như sau: ủ 370C/15’; ủ 370C/30’. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây: 560C/30’; 1000C/10’.
-
Lấy 100µl vào ống Eppendorf + Mutanolysin (nồng độ cuối 1mg/ml), ủ ở các thời gian sau: ủ 370C/15’; ủ 370C/30’. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây: 560C/30’; 1000C/10’.
2.2.7.2. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt đơn thuần (đơn giản hơn): chọn nhiệt độ, chọn thời gian xử lý nhiệt.
-
Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hình là ‘DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ’), lấy 500µl vào ống Eppendorf → ly tâm 15.000 vòng/10 phút, giữ lại 100 µl cặn +5µl Triton x 100.
-
Xử lý nhiệt ở các loại nhiệt độ như sau: 1000C/10phút; 1000C/15 phút; 1000C/20 phút; 1000C/35 phút; 900C/30’; 900C/60’; 850C/35 phút; 850C/60 phút; 800C/35phút; 800C/60phút; 800C/75phút; 800C/90phút.
Khi đã chọn được chế độ nhiệt độ, thời gian thích hợp để tách DNA đích trực tiếp trong bệnh phẩm: làm lạnh sản phẩm ở 40C, sử dụng 1- 2 µl cho phản ứng PCR
Sản phẩm của các quy trình xử lý đơn giản ở trên sẽ được so sánh với sản phẩm xử lý bằng bộ sinh phẩm (kit) của Roche “High pure PCR product Purification” có thêm xúc tác của enzym thích hợp nhất với vi khuẩn Gram dương (mutanolysin) thông qua kết quả phát hiện của PCR đa mồi hoàn thiện.
2.2.8. Áp dụng toàn bộ các quy trình đã xây dựng (xử lý bệnh phẩm, PCR đa mồi) để phát hiện vi khuẩn S. suis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng.
-
Sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi viêm màng não mủ do vi khuẩn S. suis để đánh giá tính hiệu quả của kỹ thuật xử lý đơn giản và quy trình PCR đa mồi. Số lượng mẫu bệnh phẩm tùy thuộc điều kiện thực tế thu được trong thời gian nghiên cứu, cụ thể ở nghiên cứu (NC) này là 53 mẫu bệnh phẩm thu được từ người mắc bệnh nghi do S. suis
-
So sánh kết quả phát hiện bằng PCR đa mồi với kết quả phát hiện bằng nuôi cấy phân lập và bằng PCR đơn mồi.
-
Phân tích các giá trị dương tính thực và âm tính thực của phương pháp PCR đa mồi.
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |
