TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN



tải về 0.74 Mb.
trang5/14
Chuyển đổi dữ liệu13.08.2016
Kích0.74 Mb.
#18507
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   14

1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR

1.5.1. Giới thiệu về phương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR)


PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA, tạo ra hàng ngàn, hàng triệu bản sao của một đoạn DNA có trình tự cụ thể. Kỹ thuật PCR đã được phát triển vào năm 1984 bởi một nhà hóa sinh người Mỹ tên là Kary Mullis. Mullis nhận được giải Nobel và giải thưởng của Nhật Bản phát triển PCR 1993. Tuy nhiên nguyên lý cơ bản của việc sao chép một phần của DNA bằng cách sử dụng hai mồi đã được Gobind Khorana mô tả vào năm 1971. Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử dụng rất phổ biến trong y tế, phòng thí nghiệm sinh học và nhiều ứng dụng khác. Kỹ thuật PCR có tiềm năng trở thành một trong những kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi nhất vì nó cho kết quả nhanh, chi phí rẻ và đơn giản. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể ngay cả khi số lượng DNA đích rất thấp. Phát triển kỹ thuật PCR được coi là một trong những bước đột phá trong sự phát triển của nền khoa học thế giới [40].

1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR


PCR là một phản ứng dây chuyền: Phân tử DNA được sử dụng để tạo ra 2, 4, 8… bản sao. Sự nhân lên liên tục của DNA được thực hiện bởi các protein cụ thể là polymerase, enzyme này có khả năng tổng hợp các chuỗi DNA từ các nucleotit. Để thực hiện tổng hợp DNA cần có 4 loại nucleotit là adenine (A), thymine (T), cytosine (C) và guanine (G). PCR là một phương pháp được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của bất kỳ sợi axit nucleic nào. Đây là một phương pháp khuếch đại một cách chọn lọc một đoạn DNA của hệ gen. Trong quy trình PCR gốc của Mullis, DNA sợi kép được tách thành hai sợi đơn của DNA bằng cách nung nóng nó đến 96 ° C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase của E.Coli bị phá hủy, cần phải bổ sung các enzyme mới sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR này không hiệu quả vì nó đòi hỏi nhiều thời gian, số lượng DNA polymerase lớn, và sự theo dõi liên tục trong suốt quá trình PCR [40].


Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR
(http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml)


Các bước trong phản ứng PCR

Có ba bước chính liên quan đến PCR kỹ thuật: biến tính, ủ, và kéo dài chuỗi. Trong bước biến tính, DNA bị biến tính ở nhiệt độ cao (từ 90 – 97 oC). Trong bước hai, mồi bám vào DNA sợi khuôn để kéo dài chuỗi. Trong bước thứ ba, quá trình kéo dài chuỗi xảy ra ở phần cuối của giai đoạn ủ mồi để tạo ra một bản sao của sợi DNA. Để khuếch đại một đoạn của DNA bằng PCR, DNA khuôn được làm nóng để chúng biến tính và tách thành 2 chuỗi DNA sợi đơn. Tiếp theo, một loại enzyme được gọi là "Taq polymerase" sẽ chịu trách nhiệm tổng hợp hai sợi DNA mới bằng cách sử dụng sợi DNA gốc làm khuôn. Sau quá trình sao chép sẽ tạo hai phân tử DNA mới có 1 sợi khuôn và 1 sợi mới tổng hợp. 7. Giai đoạn ủ xảy ra ở nhiệt độ thấp, 50-60 ° C. Điều này cho phép các mồi bắt cặp với các đoạn bổ sung tương ứng trên DNA khuôn. Taq polymerase thêm nucleotide có sẵn để kết thúc ủ mồi. Việc kéo dài chuỗi bằng Taq polymerase xảy ra ở khoảng 72 ° C trong 2-5 phút. DNA polymerase I không thể được sử dụng để kéo dài chuỗi bởi vì nó không ổn định ở nhiệt độ cao được sử dụng cho phản ứng PCR. Ưu điểm của chu kỳ và quy trình PCR là nó rất nhanh so với các kỹ thuật khác và mỗi chu kỳ làm tăng gấp đôi số lượng các bản sao của sợi DNA mong muốn. Sau 25-30 chu kỳ, sản phẩm PCR sẽ chứa rất nhiều bản sao của mẫu DNA ban đầu để tiến hành thử nghiệm. Nếu sử dụng thời gian tối đa cho mỗi bước, 30 chu kỳ sẽ chỉ mất 6 giờ để hoàn thành. Khi quá trình biến tính, ủ và kéo dài chuỗi được tiếp tục mồi liên tục bắt cặp với cả hai gốc DNA mẫu và bổ sung các nucleotit và tổng hợp nên sợi DNA mới. Cuối cùng, kết quả là số lượng bản sao của DNA được gia tăng theo cấp số nhân. Một DNA polymerase chịu nhiệt đã được đưa vào sử dụng trong quy trình PCR đó là enzyme Taq DNA polymerase.DNA polymerase này được phân lập từ Thermus aquaticus (Taq) phát triển trong các mạch nước phun có nhiệt độ hơn 110 ° C, và đã đóng góp rất nhiều vào việc tăng năng suất, tính đặc trưng, ​​tự động hóa, và tiện ích của phản ứng PCR. Sau chu kỳ cuối cùng, mẫu thường được ủ ở 72 ° C trong 5 phút để các sản phẩm PCR được tổng hợp một cách hoàn thiện. Để đảm bảo thành công, cần phải thực hiện tốt cả hai giai đoạn là giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và thiết lập các điều kiện của phản ứng.



Điện di: sản phẩm của đoạn DNA khuyếch đại được điện di trên thạch agarose. Tùy theo kích thước của DNA mà sử dụng loại gel agarose đơn hay phối hợp và điện trường khác nhau.

Đọc kết quả: Dựa vào DNA mẫu trên nền đèn cực tím, xác định sản phẩm khuyếch đại tương ứng với kích thước của DNA đó.

Ứng dụng của phản ứng PCR

PCR được ứng dụng nhiều trong việc điều tra và chẩn đoán của nhiều loại bệnh khác nhau. Nó là phương pháp tiêu chuẩn trong tất cả các phòng thí nghiệm thực hiện nghiên cứu với axit nucleic. Ngay cả một số kỹ thuật khác được sử dụng cũng đòi hỏi việc khuếch đại DNA là một bước cần thiết trong quy trình thực hiện. Phản ứng PCR đã được rất nhiều nhà khoa học trong những lĩnh vực nghiên cứu khác nhau. Việc sử dụng sao chép ngược để đánh giá RNA (RT-PCR) và phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR) là những tiến bộ lớn phát triển từ kỹ thuật PCR. Phương pháp PCR cho phép xác định sự thay đổi trong biểu hiện gen đã cung cấp cho các nhà khoa học sự hiểu biết sâu sắc về quá trình mắc bệnh và tạo cơ sở cho chẩn đoán và nghiên cứu khoa học cơ bản. Trong vi sinh học và sinh học phân tử, PCR được sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng DNA, phương pháp lai DNA Southern Blotte, giải trình tự DNA và công nghệ DNA tái tổ hợp. Trong vi sinh học lâm sàng, PCR đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán nhiễm vi sinh và nghiên cứu dịch tễ học. PCR cũng được sử dụng trong các phòng thí nghiệm pháp y và đặc biệt hữu ích vì chỉ cần một lượng rất nhỏ DNA đích, ví dụ chỉ cần 1 giọt máu hoặc 1 cái tóc cũng có thể cung cấp đủ lượng DNA cần thiết. Trong thực tế, một số thử nghiệm bằng cách sử dụng PCR để phát hiện một loạt các vi khuẩn trong mẫu dịch não tủy đã được báo cáo. Kể từ khi quá trình nuôi cấy C. pneumoniae gặp khó khăn trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng, phương pháp PCR đã được sử dụng để xác định vi khuẩn này trong các mẫu lâm sàng. Nested PCR là một trong những quy trình để phát hiện một vài vi khuẩn trong các mẫu lâm sàng. PCR định tính có thể được sử dụng để phát hiện không chỉ các gen của người mà còn phát hiện gen của vi khuẩn và vi rút. Một trong những ứng dụng y tế ứng dụng quan trọng nhất của PCR là phát hiện tác nhân gây bệnh. Nhiều vi rút chứa RNA hơn là DNA. Vì thế, RT-PCR được sử dụng để phát hiện các RNA của những loại vi rút này. Phương pháp PCR có thể phát hiện DNA của vi sinh vật trong bất kỳ mẫu nào, cho dù là dịch của cơ thể, thực phẩm hoặc nước uống. Phương pháp PCR định lượng cung cấp thông tin bổ sung ngoài việc đơn thuần phát hiện DNA. Phương pháp này không chỉ cho biết sự có mặt của 1 đoạn DNA cụ thể trong mẫu mà còn cho biết số lượng của đoạn DNA đó là bao nhiêu. Một ứng dụng quan trọng của PCR định lượng là trong chẩn đoán phân tử, nghĩa là việc chẩn đoán bệnh dựa trên những phát hiện phân tử chứ không phải là trên các triệu chứng sinh lý. PCR là xét nghiệm nhạy nhất với vi rút herpes simplex, vi rút varicella-zoster, và human papillomavirus. Chẩn đoán khác sử dụng bao gồm cả xét nghiệm các bệnh di truyền, bệnh ung thư, và các bệnh truyền nhiễm khác. Một ứng dụng quan trọng khác của phương pháp PCR định lượng đó là xét nghiệm HIV. Nó có thể phát hiện vi rút HIV sớm hơn trong vài tuần đầu sau khi nhiễm bệnh, nhạy hơn phương pháp ELISA [40].

Cả PCR định tính và định lượng đóng một vai trò quan trọng trong việc chiến đấu chống lại căn bệnh ung thư. PCR có thể xác định gen liên quan trong sự phát triển của ung thư. Có rất nhiều các ứng dụng PCR định lượng trong phòng thí nghiệm. Nó thường được sử dụng cho cả hai mục đích nghiên cứu cơ bản và được triển khai như một công cụ để mới phát hiện bệnh mới nổi. Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng tiềm năng, bao gồm cả phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh có mật độ thấp, các trình tự di truyền hiếm gặp, và gen biểu hiện trong tế bào đơn lẻ [40].

1.5.3. Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi

1.5.3.1. Giới thiệu chung


PCR đa mồi là một loại phản ứng khuếch đại gen nhưng không phải chỉ khuếch đại một trình tự gen đích mà có thể cùng một lúc khuếch đại hai hay nhiều hơn hai trình tự gen đích khác nhau khi sử dụng hai hay nhiều loại gen mồimồi khác nhau (primers) với cùng một quy trình khuếch đại trong cùng một ống phản ứng. Do đó, sử dụng PCR đa mồi có thể tiết kiệm được thời gian, công sức xét nghiệm và có khả năng phát hiện được hai hay nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một lúc.

Phân tích được các sản phẩm khuếch đại (sản phẩm PCR) của mỗi một cá thể (hay một tác nhân gây bệnh) từ hỗn hợp các sản phẩm PCR đã làm cho phương pháp PCR đa mồi trở thành một phương pháp sàng lọc nhanh chóng, tiện lợi cho cả lâm sàng và nghiên cứu.

Trong lĩnh vực các bệnh nhiễm trùng, PCR đa mồi là công cụ có giá trị trong việc định danh vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng.

1.5.3.2. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi

Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi


Để có được hiệu quả cao nhất khi sử dụng PCR đa mồi trong phát hiện gen đích người ta phải chú ý nhiều hơn tới mọi khía cạnh của kỹ thuật PCR như gen mồimồi (vị trí, trình tự, hàm lượng, nhiệt độ bắt cặp); hàm lượng Taq polymerase; nồng độ MgCl2; sự tương quan giữa các thành phần phản ứng và gen đích… thêm nữa là các loại thạch điện di và nồng độ thạch phối hợp.

Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và ‘khuôn’ (DNA của tế bào đích hay ‘template’). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hình thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng ‘khuôn’ hoặc cho dư thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi vì các chuỗi đích mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer).



Lựa chọn gen mồimồi:

Chiều dài của mỗi gen mồimồi ở khoảng 18-24 bp, nếu gen mồimồi có độ dài lớn hơn (30-35bp) thì dường như cũng hoạt động trong điều kiện chu kỳ tương tự như gen mồimồi có độ dài ngắn, tuy vậy gen mồimồi ở độ dài lớn có khả năng tạo các sản phẩm chính, ngăn các sản phẩm phụ trong phản ứng đa mồi.

Nếu có thể, trình tự của mỗi gen mồimồi nên được ‘bắt đầu’ và ‘kết thúc’ bởi 1-2 cặp GC.

Hai gen mồimồi trong cặp cần phải có nhiệt độ tan chảy Tm gần nhau.

Điều kiện chu kỳ và nồng độ đệm phải điều chỉnh cân xứng với mỗi cặp primer để việc khuếch đại các vùng đích được đặc hiệu.

Nồng độ gen mồimồi

Thông thường, trong mỗi phản ứng PCR đơn (khuếch đại một vùng), nồng độ phân tử dùng cho mỗi gen mồimồi từ 100 – 500 nM. Trong phản ứng PCR đa mồi, lượng mồi có thể thay đổi từ 500nM đến 15nM (trong nghiên cứu, kết quả cho thấy nếu nồng độ mồi ở 15nM sẽ không nhìn thấy sản phẩm, ở 30 nM cho sản phẩm ít…và sản phẩm PCR xuất hiện rõ nhất ở nồng độ 200nM). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nên tránh sử dụng lượng mồi quá cao hoặc quá thấp. Lượng mồi quá cao có thể gây ức chế phản ứng PCR đa mồi, nhưng ngược lại lượng mồi quá ít thì không đủ để có sản phẩm khuếch đại. Khi phản ứng khuếch đại diễn ra không đạt yêu cầu, sản phẩm ít nên khó nhận thấy mặc dù đã tối ưu các điều kiện của chu kỳ phản ứng thì việc thay đổi tỷ lệ các mồi khác nhau trong phản ứng là cần thiết, bằng cách tăng lượng mồi cho sản phẩm yếu hơn (vùng yếu) và giảm lượng mồi cho sản phẩm mạnh hơn (vùng mạnh). Nồng độ cuối cùng của các mồi (từ 40 -500nM) có thể thay đổi đáng kể trong vòng vùng này và thường được thiết lập theo kinh nghiệm [24]. Với DNA có số copy thấp hoặc có tính phức tạp cao thì nồng độ mồi nên dùng từ 300nM - 500nM (0,3 – 0,5µM). Đối với DNA có số copy cao hoặc tính phức tạp thấp nồng độ mồi được khuyên là từ 40nM – 400nM (0,04-0,4µM) [38].



Sự cân xứng giữa lượng gen mồimồi và lượng DNA khuôn (DNA đích)

Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và ‘khuôn’ (DNA của tế bào đích hay ‘template’). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hình thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng ‘khuôn’ hoặc cho dư thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi vì các chuỗi đích mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer).



Nồng độ gen mồimồi và nồng độ DNA đích:

Trong giới hạn, khi tăng nồng độ gen mồimồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng PCR. Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng được coi như một cách tối ưu phản ứng PCR.



Nồng độ dNTP và MgCl2

Về dNTP: nồng độ MgCl2 được giữ ổn định (2mM) trong khi đó tổng nồng độ các dNTP được tăng dần. Kết quả tốt nhất ở giữa 200-400µM cho mỗi loại dNTP, nếu cao hơn sự khuếch đại bị ức chế nhanh. Nếu thấp hơn (100µM mỗi loại) vẫn có sự khuếch đại nhưng lượng sản phẩm ít và sản phẩm được nhìn thấy mờ. dNTP (ở dạng cất giữ) nhạy cảm với việc đông/ tan đông. Sau 3-5 lần như vậy sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của phản ứng PCR đa mồi. Để tránh vấn đề này, nên chia nhỏ dNTP và giữ ở nhiệt độ âm (-20oC). Sự kém ổn định này của dNTP không thể hiện rõ khi chỉ khuếch đại 1 trình tự (một vùng).

Về MgCl2, phải tối ưu hóa Mg++ vì Taq DNA polymerase là 1 enzym phụ thuộc Mg. Cùng với Taq DNA polymerase, mồi của DNA khuôn và dNTPs cũng kết hợp Mg2+. Vì vậy tối ưu hóa nồng độ Mg2+ phải tùy thuộc nồng độ dNTP, DNA đích và thành phần đệm (có một số đệm đã có sẵn một lượng Mg++). Nếu mồi, DNA đích chứa chất ức chế như EDTA hoặc EGTA thì nồng độ Mg2+ có thể thay đổi. Lượng Mg2+ thừa làm cho chuỗi kép DNA bền và ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của DNA, điều này dẫn đến giảm sản phẩm. Mg2+ dư thừa cũng có thể làm bền sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi với vị trí không chính xác của khuôn dẫn đến làm giảm độ đặc hiệu. Mặt khác nếu không đủ Mg2+ cũng làm giảm sản phẩm khuếch đại [38].

Cân bằng giữa dNTP và MgCl2

Để hoạt động tốt, Taq DNA polymerase cần Mg tự do (dNTP và DNA cũng được gắn với Mg). Điều này có thể giải thích tại sao khi tăng nồng độ dNTP có thể ức chế PCR. Trong khi đó tăng nồng độ Mg thường cho hiệu quả tốt. Bằng cách kết hợp lượng dNTP và MgCl2 khác nhau. Nghiên cứu cho thấy với 200µM mỗi loại dNTP và 1,5 mM MgCl2 thường có kết quả đạt yêu cầu, tuy nhiên ở nồng độ 3mM MgCl2 thì kết quả có thể tốt hơn. Nồng độ Mg thấp sẽ giảm khả năng khuếch đại của phản ứng PCR [24,38].



Lượng DNA đích (khuôn) và Taq DNA polymerase

Khi lượng DNA đích quá thấp, sự khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả có thể đạt được ở nhiệt độ bắt cặp thấp hơn. Thử nghiệm những nồng độ khác nhau của Taq DNA polymerase cho thấy nồng độ enzym hiệu quả nhất khoảng 2,5U/50µl thể tích phản ứng. Lượng enzym thừa, do nồng độ glycerol ở dung dịch gốc dẫn đến sự khuếch đại không cân xứng giữa các trình tự khác nhau. Tỷ lệ kéo dài của phân tử lai mồi - đích phụ thuộc vào hoạt tính của enzym này và sự có mặt của các thành phần cần thiết như MgCl2, dNTP và bản chất của DNA đích. Vì vậy vấn đề chủ yêú để thay đổi PCR phải tác động trực tiếp đến các yếu tố ảnh hưởng tới sự bắt cặp hoặc kéo dài hoặc cả hai [38].

Lượng gen đích có mặt trong mẫu ảnh hưởng mạnh tới hiệu quả PCR. Nếu lượng gen đích rất ít, điều kiện của phản ứng hay chu trình phản ứng cần phải được thay đổi, cải tiến để thích nghi nhằm đạt hiệu quả phát hiện.

Nồng độ đệm PCR

Qua khảo sát cho thấy đệm PCR cho hiệu quả tốt là 1,6 x của các thành phần đệm PCR sau đây: KCl (50mM), Tris HCl pH 8,3 (10mM) và MgCl 2 (1,5mM).

Một số khảo sát cho thấy tăng nồng độ đệm lên 2 lần sẽ tăng hiệu quả của phản ứng PCR đa mồi. Việc này hiệu quả hơn bất cứ tá dược nào được thử nghiệm như DMSO, glycerol hoặc albumin huyết thanh bò. Những cặp mồi với sản phẩm khuếch đại dài hơn hoạt động tốt hơn ở các nồng độ muối thấp hơn trong khi những cặp mồi có sản phẩm khuếch đại ngắn hơn hoạt động tốt hơn ở các nồng độ muối cao hơn [24].

Sử dụng tá dược: DMSO, glycerol, BSA

Những phản ứng PCR đa mồi khó khăn nhất có thể được cải thiện nhờ việc thêm vào phản ứng những chất như DMSO, glycerol và formamide.. do chúng làm lỏng lẻo chuỗi DNA giúp cho biến tính khuôn dễ hơn, đặc biệt đối với những DNA đích lớn, giàu GC.

Trong PCR đa mồi, DMSO và glycerol ở nồng độ 5 – 10% (v/v) giúp tăng hiệu quả khuếch đại của PCR (tăng sản phẩm PCR) và tăng tính đặc hiệu (không có sản phẩm phụ). Tuy nhiên, việc sử dụng những chất phụ thêm này cần được thử nghiệm trong từng trường hợp. BSA với nồng độ 0,8µg/µl làm tăng hiệu quả PCR hơn rất nhiều so với DMSO hay glycerol [45].


Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 0.74 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   14




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương