CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Streptococcus suis
Để hoàn thiện và chuẩn hoá các điều kiện của phản ứng PCR, trong đề tài đã sử dụng chủng vi khuẩn Streptococcus suis typ 2 phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng của người (từ máu và dịch não tủy) được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm “ Vi khuẩn Hô hấp” khoa Vi khuẩn, Viện VSDTTW để tạo bệnh phẩm mô phỏng phục vụ thực nghiệm.
Vi khuẩn S. suis gây bệnh được kiểm tra dựa trên:
-
Tính chất bắt màu trong nhuộm Gram;
-
Thử nghiệm Catalaze;
-
Phân nhóm huyết thanh Lancefield: S. suis phải thuộc liên cầu nhóm D;
-
Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng bộ sinh phẩm ‘API 20 Strep’ (Bio Mérieux);
-
Xác định typ huyết thanh phổ biến gây bệnh cho người: ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2.
Một số chủng vi khuẩn khác để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện
Một số chủng vi khuẩn gây viêm màng não mủ điển hình như Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae typ b và một số vi khuẩn khác cùng nhóm liên cầu nhưng không phải S. suis (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae) và tế bào bạch cầu người.
2.1.2. Dịch não tủy nền
Là loại dịch não tủy được thu thập từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp hoặc viêm não vô khuẩn: 100 mẫu dịch não tủy thu được từ bệnh nhân có hội chứng não cấp (HCNC) hoặc viêm não vi rút, đã được khẳng định âm tính với vi khuẩn để tạo bệnh phẩm nền và sử dụng như mẫu chứng âm tính thật với S. suis.
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): -
53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não mủ do S. suis.
-
44 mẫu đã được khẳng định chắc chắn là vi khuẩn S. suis bằng nuôi cấy phân lập.
-
09 mẫu âm tính trong NCPL nhưng dương tính với S. suis trong PCR đơn mồi
-
100 mẫu bệnh phẩm âm tính thực sự với vi khuẩn S. suis (cả bằng phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR), gồm:
-
29 mẫu từ bệnh nhân người lớn có các dấu hiệu thần kinh – liệt chi không rõ nguyên nhân/ hội chứng não cấp).
-
71 mẫu DNT của TE ≤ 24 tháng tuổi không có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/có chẩn đoán xác định VN vi rút hoặc vi khuẩn khác không phải S. suis như Hib, phế cầu và não mô cầu (được lấy trong CT giám sát VMN mủ ở TE của PTN VKHH).
2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu:
Môi trường và sinh phẩm nuôi cấy định danh vi khuẩn S. suis:
-
Môi trường thạch máu cừu 5% (Columbia sheep blood agar plate, BD [Cat. 251165]).
-
Dung dịch H2O2 3%
-
Bộ API Rapid ID 20 Strep (BioMérieux).
-
Bộ kháng huyết thanh Lancefield (BioMérieux)/Streptex (Remel Cat: 30950501])
-
Kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2 (serology, Đan Mạch)
-
Bộ nhuộm Gram (DIFCO- Becton Dickinson, USA)
-
Lam kính và lá kính phủ
Sinh phẩm tách chiết DNA của vi khuẩn:
-
High pure PCR Purification Kit (Roche Co.,)
-
Lysozyme (MP Biomedicals, Inc. Cat 100834).
-
Mutanolysin (Sigma Co.,).
-
Triton X 100
Sinh phẩm PCR:
-
Ready-To-Go PCR Mastermix Kit (Amersham Co.,) hoặc Hotstartaq Master Mix Kit (QIAgen), mỗi phản ứng bao gồm: Taq poly 2,5 units; 200µM mỗi loại dNTP; 1,5mM MgCl2; 10mM Tris-HCl [pH9,0]; 50mM KCl; BSA [Bovine Serum Albumine].
-
25 mM MgCl2 (Invitrogen/Fermentas)
-
Nước tinh sạch (Sartorius).
-
Thạch Seakem GTG Agarose và Nusieve GTG Agarose (Cambrex Bio Science Rockland, Inc. USA).
-
Đệm điện di: TAE 10x (Promega Corporation USA)
-
Chất nhuộm sản phẩm điện di: ethidiumbromide
-
Loading buffer (Novagen Co.)
-
100bp ladder (Markers) Novagen Co..
Các cặp gen mồimồi:
Đề tài sử dụng các cặp mồi từ tài liệu tham khảo, đánh giá lại từng cặp, tạo tổ hợp các cặp mồi thoả mãn các yêu cầu nghiên cứu. Bảng 1 trình bày tên và trình tự các cặp mồi được sử dụng.
Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong nghiên cứu [11,25,39,41]
Loại gen
|
Ký hiệu
|
Trình tự
|
Vị trí
|
Sản phẩm PCR (bp)
|
16S-rDNA
|
195s & 489as2
|
5′- CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT -3′
5′- GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3′
|
172-195
469-490
|
294
|
Gdh
|
gdh1 &gdh2
|
5’-AAG TTC CTC GGT TTT GAG CA-3’
5’-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3’
|
631-650
1196-1177
|
566
|
Gdh
|
Str2-F
Str2-R
|
5’-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3’
5’-CCA TGG ACA GAT AAA GAT GG-3’
|
1177-1196
508-527
|
688
|
Epf
|
epf-F
epf –R
|
5’-CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA-3’
5’- AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG-3’
|
2401-2419
3143-3124
|
744
|
Suilysin
|
Sly-F
Sly-R
|
5’-GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA-3’
5’-CCG CGC AAT ACT GAT AAG C-3’
|
115-134
344-362
|
248
|
Arginine deminase
|
arcA-F
arcA-R
|
5’-TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC-3’
5’-GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG-3’
|
1225-1244
1342-1324
|
118
|
Protein được giải phóng bởi muramidase – MRP
|
mrp-F1
mrp-F2
mrp-R
|
5’-GAC AGA TGG TGA GGA AAA TGG-3’
5’-ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG-3’
5’-TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT-3’
|
3636-3655
3823- 3804
|
188
|
Cấu trúc vỏ polysaccharide
(typ HT)
|
cps2J-F
cps2J-R
|
5’-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3’
5’-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC-3’
|
13918-13937
14415-14396
|
498
|
cps2JJ-F
cps2JJ-R
|
5’- GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3’
5’- CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3’
|
|
498
|
2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ -
Tủ ấm CO2;
-
Máy đo DNA (nanodrop);
-
Máy ủ nhiệt (Wise Therm)
-
PCR Mastercycler epgradient S (Eppendorf)
-
Máy điện di (Weal Tec)
-
Máy chụp ảnh điện di (UVP)
-
Các loại máy ly tâm: Máy ly tâm lạnh 14000 vòng (BioFuge)…
-
Spin down (của Eppendorf và Nhật Bản)
-
Lam kính và lá kính phủ
-
Ống nghiệm 1.5 ml Eppendorf; ống chạy PCR 0,2ml
-
Các loại đâu tip có màng lọc chuyên dụng cho SHPT
-
Micropipet, Pipet Pasteur
-
Que cấy
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |