Bệnh lở mồm long móng (fmd) là bệnh truyền lây mạnh nhất của thú có vú và có khả năng gây ra tổn thất kinh tế nặng nề trên chăn nuôi gia súc móng guốc mẫn cảm

Mối liên quan giữa dòng virus thực địa và dòng virus vaccin cũng có thể được xác định bằng cố định bổ thể, sử dụng kháng huyết thanh của chuột lang sinh ra kháng với dòng virus vaccin tương ứng.

Các hiệu giá CFT 50% của huyết thanh kháng với các kháng nguyên, đã được chuẩn bị từ dòng virus vaccin và dòng virus thực địa, được so sánh để xác định tính kháng nguyên “giống nhau” đến mức nào giữa dòng virus vaccin và dòng virus thực địa.

1. 
   Các dòng virus thực địa được cấy truyền trên các tế bào nôi cấy cho đến khi thích ứng để cho ra 100% tác động gây bệnh tích tế bào trong 24 giờ. Các lượt cấy truyền phải giữ tối thiểu. Khi đã thích ứng, xác định được hiệu giá virus mà cố định 2,5 CFU₅₀ (50% đơn vị cố định bổ thể - complement fixing units).
   
2. 
   Một mối liên quan được thiết lập bằng chuẩn độ kháng huyết thanh chuột lang qua các chuỗi pha loãng gấp hai lần dựa vào 2,5 CFU₅₀ các kháng nguyên tương đồng và dị hợp trong dịch đệm veronal (veronal buffer diluent – VBD) hay dung dịch muối và borate (borate saline solution – BBS) được cho vào các ống riêng. Sau đó bốn đơn vị dung huyết của bổ thể được cho vào từng ống để tạo phản ứng.
   
3. 
   Hệ thống xét nghiệm này được ủ ở 37^oC trong 30 phút trước khi thêm 2% tế bào hồng cầu cừu đã được chuẩn độ (standardised sheep red blood cells – SRBC) vào VBD hay BSS, tế bào hồng cầu này đã được tạo mẫn cảm với huyết thanh thỏ kháng SRBC. Các tác nhân thử được ủ ở 37^oC thêm 30 phút và các ống này sau đó được ly tâm và đọc.
   
4. 
   Các hiệu giá CFT 50% được tính toán bằng phương pháp Spearman-Kärber và giá trị ‘r’ được lấy ra từ mối liên quan giữa phản ứng với dòng virus thực địa và phản ứng với dòng virus vaccin, như sau:
   

mẫu số hiệu giá của huyết thanh siêu miễn dịch kháng với virus vaccin

5. 
   Giải thích các kết quả: trong trường hợp này của CFT, các giá trị r₁ lớn hơn 0,25 chỉ ra rằng dòng virus thực địa là đủ tương đồng với dòng virus vaccin và việc sử dụng vaccin này có thể cho ra bảo hộ đối với thử thách bằng dòng virus thực địa này (3).
   

Tỷ lệ bảo hộ mong muốn (expected percentage of protection) ước tính khả năng mà bò sẽ được bảo hộ đối với thử thách của 10.000 liều gây nhiễm sau một lần chủng vaccin hay chủng vaccin tăng cường.

1. 
   Cần có huyết thanh riêng biệt của 16 hay 30 bò lứa tuổi 18-24 tháng ở 30 ngày sau cấp vaccin và 30 ngày sau tái chủng, sử dụng đủ liều lượng của dòng virus vaccin sẽ được so sánh.
   
2. 
   Bộ huyết thanh này được kiểm tra về các hiệu giá kháng thể đối với dòng virus vaccin tương ứng và dòng virus thực địa sẽ đem so sánh, sử dụng VNT hay LPB-ELISA (xem Đoạn B.2.a và B.2.c).
   
3. 
   Nếu cần, các kháng nguyên được sử dụng trong ELISA có thể được làm bất hoạt trước khi sử dụng binary ethyleneimine.
   
4. 
   EPP được xác định từ hiệu giá huyết thanh có được, cho từng huyết thanh riêng rẽ, bằng tham chiếu đến các bảng đã xác định trước về liên quan giữa các hiệu giá huyết thanh với bảo hộ lâm sàng. Theo cách này EPP được tính toán từ EPP cho từng huyết thanh riêng rẽ.
   
5. 
   Dữ liệu bảo hộ lâm sàng lấy từ các thực nghiệm tiến hành trước đó, trên hàng trăm con bò có miễn dịch bằng sử dụng dòng virus vaccin được đề cập và được thử thách với virus tương đồng (giống như xét nghiệm khả năng PGP đã mô tả trong Đoạn D.4.b). Từng con thú được chấm điểm là có bảo hộ hay không và các bảng liên hệ dựa vào các phương pháp luận lý hồi quy được thiết lập giữa hiệu giá kháng thể và bảo hộ lâm sàng.
   
6. 
   Một EPP <75% (khi sử dụng huyết thanh từ một nhóm 16 thú vật đã tái chủng vaccin) và <70% (khi sử dụng nhóm huyết thanh từ một nhóm 30 thú vật đã tái chủng vaccin) là một chỉ thị rằng vaccin này sẽ cho ra bảo hộ thấp đối với virus thực địa (47).
   

Việc kiểm soát FMD thường là trách nhiệm của quốc gia và ở nhiều quốc gia, vaccin chỉ có thể được sử dụng dưới kiểm soát của Quan chức có Thẩm quyền.

Các hướng dẫn về sản xuất các vaccin thú y được nêu trong Chương 1.1.8 Các nguyên tắc về sản xuất vaccin thú y. Các hướng dẫn nêu ra ở đây và ở Chương 1.1.8 có định hướng chung và có thể được bổ sung theo yêu cầu quy định của quốc gia hay vùng. Các yêu cầu khác nhau liên quan đến chất lượng, tính an toàn và tính hiệu quả áp dụng trong từng quốc gia hay vùng, để cho các nhà sản xuất thấu hiểu và cho việc cấp phép đối với một vaccin thú y. Nếu có thể, các nhà sản xuất phải có được cấp phép cho vaccin FMD của mình theo kiểm tra độc lập về chất lượng sản phẩm của họ.

Virus FMD độc lực phải được sử dụng để sản xuất vaccin FMD; do đó, cơ sở sản xuất vaccin FMD phải được vận hành dưới các biện pháp và thực hành an toàn sinh học phù hợp. Cơ sở phải hội đủ các yêu cầu đối với mầm bệnh Khu trú Nhóm 4 như đã nêu trong Chương 1.1.2 của Hướng dẫn này.

Thủ tục áp dụng vaccin phòng ngừa FMD được áp dụng trong nhiều quốc gia hay vùng mà đã được ghi nhận là sạch bệnh lở mồm long móng bằng áp dụng vaccin, và trong những quốc gia mà bệnh đang hoành hành. Ngược lại, một số quốc gia sạch bệnh không bao giờ sử dụng vaccin đại trà cho gia súc mà chỉ sử dụng cho kiểm soát di chuyển và lọc ra thú vật bị nhiễm và tiếp xúc khi xảy ra ổ dịch. Hơn nữa, nhiều quốc gia sạch bệnh duy trì chọn lựa về sử dụng vaccin và có chiến lược tồn trữ các chế phẩm virus bất hoạt có hàm lượng cao. Kháng nguyên dự trữ này tạo khả năng cung cấp kháng nguyên cho chế tạo vaccin để đối phó với tính trạng “khẩn cấp” trong một giai đoạn ngắn (26).

Các vaccin FMD có thể được định nghĩa là một công thức cố định chứa các hàm lượng cố định (các giới hạn) của một hay nhiều chế phẩm lấy từ tế bào nuôi cấy đã làm bất hoạt bằng hòa học, của một dòng virus giống gốc, được phối trộn với một hay nhiều chất phụ gia và các tá dược (excipient). Các vaccin được lập công thức cho mục đích đặc trưng và trong trường hợp các vaccin có hướng sử dụng trên heo, chất dầu phụ gia là thích hợp. Các vaccin có phụ gia chất dầu cũng có thể sử dụng cho thú nhai lại và có thể có lợi về mặt ít gây cản trở đối với kháng thể mẹ truyền và kéo dài thời gian miễn dịch. Các vaccin FMD có thể được phân loại hoặc là các vaccin có hiệu lực “theo chuẩn” hay “cao hơn”. Các vaccin có hiệu lực theo chuẩn được tổng hợp để chứa đủ kháng nguyên đảm bảo cho vaccin đạt được mức độ hiệu lực tối thiểu cần có (được khuyến cáo ở Đoạn D.4.b là 3 PD₅₀ [50% liều bảo hộ - protective dose]). Các vaccin có hiệu lực cao được tổng hợp với hàm lượng kháng nguyên cao, có khả năng cho ra hiệu lực cao hơn so với yêu cầu tối thiểu, để cho ra các đặc trưng như nhanh chóng xuất hiện miễn dịch và kháng thể phổ rộng đối với các virus thực địa có liên quan. Do đó vaccin có hiệu lực cao thì thích hợp với sử dụng khẩn cấp. Các vaccin sống của FMD là không chấp nhận do nguy cơ về chuyển đổi trở lại thành độc lực và do việc sử dụng vaccin sẽ làm khó khăn trong phân biệt giữa thú vật bị nhiễm với thú vật đã sử dụng vaccin.

Do sự hiện diện của đa chủng huyết thanh của virus, nhiều vaccin FMD là đa giá và là áp dụng thường xuyên để chế tạo các vaccin từ hai hay nhiều dòng virus khác nhau. Trong một số khu vực, khuyên rằng vaccin nên gồm nhiều hơn một virus mỗi chủng huyết thanh để đảm bảo bao trùm rộng phổ tính kháng nguyên đối với các virus lưu hành.

1. Quản lý giống virus

a) Phân loại giống virus

Chọn lựa virus giống gốc (master seed viruses – MSVs) một cách lý tưởng là dựa vào khả năng chúng dễ dàng phát triển trong tế bào nuôi cấy, lượng virus thu được, tính ổn định và phổ kháng nguyên rộng (57). Các virus giống gốc sẽ được phân loại và phân phối bởi các phòng thí nghiệm đối chứng chính thức trong các vùng mà những phòng thí nghiệm này hiện diện; virus giống gốc sẽ được chọn lựa phù hợp với tầm quan trọng dịch tễ của từng dòng.

Khi mà không có dòng virus vaccin thích hợp sẵn có, các dòng virus vaccin mới được lấy từ thiết lập các virus giống gốc từ dòng phân lập thực địa bằng cách tạo thích ứng cho chúng phát triển trong giá thể hay các tế bào đơn lớp qua các chuỗi cấy truyền. Để loại trừ nguy cơ vấy nhiễm các virus có vỏ bao lipid, khuyên rằng cho virus giống gốc qua xử lý hòa tan hữu cơ trước hay trong quá trình tạo thích ứng. Thích hợp là giữ cho số lần cấy truyền tối thiểu qua tế bào nuôi cấy vì ở đây có bằng chứng về “trôi dạt - drift” kháng nguyên của virus FMD trong quá trình cấy truyền.

Virus giống gốc phải có tính kháng nguyên, và nếu có thể thì tính di truyền (genetically) được phân loại và chứng minh được là tinh khiết và sạch khỏi các tác nhân ngoại lai đã liệt kê bởi cấp phép. Tính tương đồng phải được thiết lập với dòng phân lập đơn cử và chứng minh được tính hiệu quả đối với dòng lưu hành mà từ đó virus giống gốc phát triển thành. Chứng minh này thường bao gồm một số phương pháp, tin cậy nhất là xét nghiệm bảo hộ chéo ở nội môi trường. Cách khác, các xét nghiệm ở nội môi trường (thích hợp là trung hòa virus) cũng có thể áp dụng, mà cần đến sự sẵn có của huyết thanh sau khi cấp loại vaccin kháng với những virus giống gốc này. Các virus giống gốc có thể được bảo quản ở -20^oC nếu được ướp glycerin (glycerinated) hay ở nhiệt độ thấp hơn (-70^oC) nếu không ướp glycerin. Giống virus dùng chế tạo vaccin có thể được nhân lên trong một hay vài lần cấy truyền từ virus giống gốc và được sử dụng để gây nhiễm mội trường tế bào nuôi cấy thành phẩm ở tỷ lệ khoảng 1 CFU (đơn vị hình thành khuẩn lạc – plate forming unit) trên 100 tế bào. Khi có thể, nguồn gốc chính xác của dòng phân lập phải được ghi chép và phải bao gồm các chi tiết như vị trí, loài và chủng loại của chất liệu mà từ đó lấy ra virus. Lịch sử cấy truyền ở ngoại môi trường của virus phải được ghi chép. Cũng phải cân nhắc đến giảm thiểu nguy cơ truyền lây các tác nhân gây bệnh tích nhũn não truyền nhiễm (transmissible spongiform encephalopathy agents – TSEs) bằng cách đảm bảo rằng các chất liệu có nguy cơ TSE là không sử dụng làm nguồn của virus hay trong mọi môi trường dùng cho sinh sôi virus.

Phương pháp được khuyến cáo cho cấy truyền giống virus để sản xuất kháng nguyên, là nuôi cấy virus FMD trong môi trường giá thể quy mô lớn hay các đơn lớp sử dụng các lớp tế bào trong các điều kiện vô trùng. Môi trường tế bào nuôi cấy sơ cấp (primary cell culture) có thể chấp nhận được cho sản xuất vaccin ở một số quốc gia, nhưng chỉ khi phương pháp sản xuất là hoàn toàn tuân thủ với Thực hành Sản xuất Tốt, áp dụng một phương pháp sản xuất đã được chấp nhận để đảm bảo làm bất hoạt tất cả các tác nhân ngoại lai có thể có và thực hiện các xét nghiệm đầy đủ trong quá trình sản xuất và thành phẩm, để đảm bảo tính ổn định và tính an toàn của thành phẩm. Điều cốt yếu là tất cả các dụng cụ hút pha và các bình chứa phải hoàn toàn vô trùng, đảm bảo không có khu vực nào trong hệ thống sản xuất là nơi chứa chấp visinh vật. Ngoài các quan tâm chung về tính vô trùng, quan trọng là virus có thể bị tổn thương bởi các enzyme phân hủy protein, giống như ở vi khuẩn (22). Việc kiểm soát pH và nhiệt độ cũng là tiêu chuẩn vì độ acid và nhiệt độ làm virus không bền bỉ (21). Nhiệt độ tối ưu cho tế bào, virus phát triển ở khoảng 37^oC và 26^oC cho làm bất hoạt, điều kiện này phải được kiểm soát một cách chính xác. Trong các giai đoạn khác của sản xuất, nhiệt độ phải giảm xuống từ 4-6^oC. Virus phải được duy trì ở khoảng pH 7,6 và không bao giờ dưới 7,0.

Một dòng virus thích hợp được sử dụng để gây nhiễm một giá thể hay các đơn lớp của một lớp tế bào đã được thiết lập, như BHK. Những tế bào nuôi cấy này phải chứng minh là sạch đối với vi sih vật vấy nhiễm. Trong quá trình phục hồi virus, chúng được nhân giống trong môi trường dinh dưỡng với một thể tích và mật độ tế bào phù hợp cho cấy giống. Theo một ước tính, môi trường nuôi cấy được cấy với mật độ tế bào ban đầu từ 0,2-0,5 x 10⁶ tế bào/ml, mà cho phép sinh sôi thành 2-5 x 10⁶ tế bào/ml trước khi được gây nhiễm virus.

Khi virus đạt đến hiệu giá tối đa, được xác định theo khả năng gây nhiễm bằng xét nghiệm CF hay các xét nghiệm khác, thì môi trường nuôi cấy được gạn lọc, thường bằng xử lý chloroform sau đó ly tâm và lọc. Sau đó virus được làm bất hoạt bằng thêm vào ethyleneimine, thường dưới dạng binary ethyleneimine (BEI). Ethyleneimine thường được chuẩn bị bằng pha loãng, đến một nồng độ 0.1 M, 2-bromoethylamine hydrobromide trong dung dịch 0.2 N sodium hydroxide, và được ủ ở 37^oC trong 1 giờ (9, 10). BEI này sau đó được pha vào một giá thể virus và đặt ở 26^oC, để cho ra nồng độ cuối cùng là 3 mM. Quá trình làm bất hoạt thường liên tục trong 24 giờ, sau đó thêm một liều lượng BEI thứ nhì với 24 giờ nữa. Thời gian cho xử lý BEI và nhiệt độ áp dụng làm bất hoạt phải được đánh giá về các điều kiện thực tế và thiết bị sử dụng. Sau khi làm bất hoạt, mọi tồn dư BEI trong thu hoạch có thể được trung hòa bằng thêm vào dung dịch sodium thiosulphate cho đến nồng độ cuối cùng là 2%. Để làm giảm khả năng virus tiếp xúc với BEI mà còn sống ở lần làm bất hoạt thứ nhì, điều cốt yếu là chuyển ngay chất chứa đến bình chứa vô trùng thứ nhì để phản ứng hoàn tất trong 48 giờ.

Virus đã làm bất hoạt có thể được cô đậm bằng siêu lọc, bằng chất ngưng kết polyethylene glycol hay chât hấp phụ polyethylene oxide (1, 62), virus bất hoạt đã được cô đậm có thể được tinh lọc thêm bằng các biện pháp như sắc ký (chromatography). Những kháng nguyên cô đậm này có thể bảo quản ở -72^oC hay nhiệt độ thấp hơn trong nhiều năm, nếu cần, và được dùng chế tạo vaccin khi cần đến trong chất đệm thích hợp và thêm vào phụ gia (24).

Các vaccin FMD thông thường được tổng hợp là tan trong nước (aqueous) hay phụ gia dầu (oil adjuvant). Vaccin tan trong nước, thường được sử dụng cho bò, được chế tạo bằng hấp phụ virus vào chất keo aluminium hydroxide, một trong các phụ gia thường dùng phối trộn vaccin thành phẩm. Các thành phần khác của phối trộn thành phẩm bao gồm chất chống bọt (antifoam), màu đỏ phenol (nếu được phép của quốc gia đặt hàng), albumin sữa thủy phân (lactalbumin hydrolysate), canh tryptose phosphate, các amino acids, vitamins và muối đệm (buffer salts). Một phụ gia thứ nhì cũng được thêm vào là saponin, được lấy từ loài cây ở Nam Mỹ là Quillaja saponaria mollina, cũng như một chất bảo quản khác như merthiolate hay chloroform.

Các vaccin phụ gia dầu (oil-adjuvanted vaccines) thường được tổng hợp bằng sử dụng dầu khoáng, như Marcol và Drakeol, làm phụ gia. Những chế phẩm này có một số lợi thế hơn so với vaccin bình thường aluminium hydroxide/saponin, nhưng không thể hiện lợi thế về hiệu quả ở heo. Các vaccin này được sử dụng rộng rãi để cấp cho bò ở Nam Mỹ vì tạo nên miễn dịch lâu dài. Dầu khoáng thường được trộn trước với một tác nhân nhũ hóa, như mannide monooleate, trước khi tổng hợp thành vaccin theo tỷ lệ, thành dạng lỏng của vaccin, và nhũ hóa bằng sử dụng sữa kết dính hay nhũ hóa bằng cơ học trong máy sóng siêu âm. Các dạng nhũ hóa phức tạp hơn (nước/dầu/nước) có thể được tạo ra bằng quá trình nhũ hóa trong dạng lỏng có chứa lượng nhỏ chất tẩy như Tween 80 (37).

Một chọn lựa khác là sử dụng dạng nhũ dầu “sử dụng ngay”. Chất dầu chứa các esters của acid octadecenoic và 2,5 anhydro-d-mannitol, thí dụ, là dạng chế sẵn của nhũ dầu kép hay hỗn hợp (nước/dầu/nước) mà có cả đặc tính bền bỉ lẫn đặc tính độ nhớt thấp, mà không cần đến thiết bị tạo huyền phù phức tạo (11, 26). Khi sử dụng các thành phần mới, bao gồm các nhũ dầu, trong mọi vaccin, điều quan trọng là phải tính đến tồn dư trong sản phẩm thực phẩm lấy từ loài thú vật được cấp vaccin, để đảm bảo rằng vaccin có thể được cấp phép trong liên quan đến an toàn của người tiêu thụ thực phẩm. Những yếu cầu này làm giới hạn đáng kể việc chọn lựa chất phụ gia để sử dụng cho các loài thú vật dùng làm thực phẩm.

Thông thường, các hiệu giá virus đạt mức tối ưu trong vòng 24 giờ sau khi nuôi cấy trong tế bào. Thời điểm chọn lựa để thu hoạch mẻ cấy có thể dựa vào một số đánh giá; thí dụ như đánh giá tế bào chết. Hàm lượng virus có thể được đánh giá bằng xét nghiệm khả năng gây nhiễm, các kỹ thuật thể hiện mật độ sucrose (sucrose density gradient) (23) hay huyết thanh học. Thích hợp là sử dụng một phương pháp để đo lường khối kháng nguyên, như các phân tích mật độ sucrose, cũng như đo lường khả năng gây nhiễm, là hai đặc tính không cần phải trùng khớp và các phương pháp khác nhau có thể bổ sung cho phương pháp trên.

Trong quá trình làm bất hoạt virus, phải lấy mẫu theo thời điểm ở các khoảng cách đều đặn với mục dích theo dõi tốc độ và tuyến tính của quá trình làm bất hoạt. Các hiệu giá virus trong các mẫu được xác định bằng cấy vào các tế bào nuôi cấy mà đã chứng minh được là có mẫn cảm cao với virus FMD, như BHK hay tế bào tuyến ức của bò (bovine thyroid cell). Những tế bào nuôi cấy này cho phép xét nghiệm đầy đủ theo thống kê dưới các điều kiện có khả năng lặp lại. Cơ số 10 (log₁₀) của khả năng gây nhiễm của các mẫu từng thời điểm được biểu diễn theo thời gian, và quá trình làm bất hoạt không được coi là hoàn toàn nếu phần cuối của đường biểu diễn và phép ngoại suy không cho thấy rằng có ít hơn một hạt gây nhiễm trên 10⁴ lít dung dịch chế phẩm ở cuối giai đoạn làm bất hoạt.

4. Xét nghiệm trên thành phẩm

a) Tính an toàn (Safety)

Các xét nghiệm về tính vô hại (innocuity) (khả năng không gây nhiễm) được thực hiện hiệu quả nhất trên khối virus đã làm bất hoạt và đã được cô đậm (xem Đoạn D.3 và D.5 dưới đây). Tuy nhiên có thể xác nhận tính vô hại bằng xét nghiệm virus lấy từ vaccin, đây là khả năng áp dụng không được đồng thuận đối với mọi công thức và không tin cậy cho xét nghiệm các kháng nguyên đã cô đậm. Thí dụ, saponin ảnh hưởng mạnh đến quá trình tách xuất virus FMD ra khỏi các vaccin aluminium hydroxide/saponin (25). Nếu phương pháp tách xuất là thích hợp cho một công thức đặc trưng, thì xét nghiệm có thể được đánh giá bằng cấy song song các mẫu vaccin tìm dấu vết virus sống (12).

Với mục đích có được chấp thuận cấp phép, một lô thử nghiệm của vaccin phải được xét nghiệm về độc tính cục bộ và toàn thân theo đường cấp vaccin đã được khuyến cáo, trong một thử nghiệm ở nội môi trường với số lượng bò thích hợp (27). Các xét nghiệm phải được thực hiện với liều gấp đôi và liều nhắc lại sử dụng vaccin đã được tổng hợp chứa tối đa hàm lượng được phép và số lượng các kháng nguyên, với giao thức tương tự như nêu dưới đây để xét nghiệm tính an toàn của lô vaccin.

b) Tính hiệu lực (potency)

Bò ít nhất 6 tháng tuổi, từ những vùng sạch bệnh FMD mà trước đó chưa được cấp vaccin FMD và sạch đối với kháng thể kháng các chủng khác nhau của virus FMD sẽ được xét nghiệm. Chia thành ba nhóm không dưới năm con bò mỗi nhóm, sẽ được cấp vaccin theo đường cấp đã khuyến cáo bởi nhà sản xuất. Vaccin phải được cấp ở các liều lượng khác nhau theo mỗi nhóm bò, bằng cách tiêm các thể tích vaccin khác nhau. Thí dụ, nếu nhãn vaccin nêu rằng tiêm 2ml tương ứng một liều vaccin, thì ¼ liều của vaccin sẽ có được bằng tiêm 0,5 ml, và 1/10 liều sẽ có được bằng tiêm 0,2 ml. Những con thú này và nhóm đối chứng gồm hai con thú không được tiêm vaccin được thử thách lúc, hoặc là 3 tuần (với vaccin tan trong nước) hay đến 4 tuần (với vaccin nhũ dầu) sau khi cấp vaccin, bằng giá thể chứa virus của bò mà có độc lực đầy đủ và tương đồng với các chủng virus trong vaccin đem xét nghiệm, bằng cách truyền vào ở hai vị trí phần trên biểu bì lưỡi bò với lượng tương đương 10.000 ID₅₀ (50% liều gây nhiễm cho bò – bovine infectious dose) (0,1 ml mỗi vị trí). Các con thú được quan sát trong ít nhất 8 ngày. Các con thú không được bảo hộ sẽ thể hiện bệnh tích ở các nơi khác ngoài lưỡi. Các con thú đối chứng phải phát triển các bệnh tích trên ít nhất ba chân. Từ số lượng các con thú được bảo hộ trong từng nhóm, tính ra được PD₅₀ (50% liều bảo hộ cho bò – bovine protective dose) chứa trong vaccin. Ở đây có nhiều phương pháp khác nhau để tính ra PD₅₀, nhưng các phương pháp dựa vào phương pháp Kärber (38) thường thích hợp nhất. Vaccin phải chứa ít nhất 3 PD₅₀ mỗi liều đối với bò, khi được áp dụng cho thủ tục phòng ngừa, tuy nhiên 6 PD₅₀ mỗi liều thì thường thích hợp hơn. Trong một số trường hợp, vaccin có hiệu lực cao sẽ cản trở phát triển các bệnh tích cục bộ trên lưỡi ở vị trí tiêm thử.

Với xét nghiệm PGP (tỷ lệ phần trăm bảo hộ đối với bệnh nhiễm chung ở chân móng – percentage of protection against generalised foot infection), một nhóm 16 bò huyết thanh âm tính với FMD có lứa tuổi ít nhất 6 tháng, với cùng các đặc điểm nêu ở xét nghiệm PD₅₀, được cấp vaccin với liều lượng đủ, theo đường cấp được khuyến cáo của nhà sản xuất. Những con thú này và nhóm đối chứng gồm hai con thú không được cấp vaccin, được thử thách vào lúc 4 tuần hay lâu hơn sau khi cấp vaccin, bằng dòng virus thử thách, là một giá thể chứa virus của bò mà có độc lực đầy đủ và tương đồng với chủng virus trong vaccin được xét nghiệm, bằng cách cấy vào tổng cộng 10.000 BID₅₀ (50% liều gây nhiễm cho bò), vào dưới biểu bì ở ít nhất hai vị trí ở mặt trên lưỡi. Các con thú không có bảo hộ thể hiện các bệnh tích ở các nơi khác ngoài lưỡi, trong vòng 7 ngày sau khi cấy truyền. Các con thú đối chứng phải phát triển các bệnh tích ở các vị trí trên ít nhất ba chân; với áp dụng cho phòng ngừa, vaccin này phải bảo hộ ít nhất 12 con thú trong 16 con được cấp vaccin. Các con thú được quan sát vào 7-8 ngày sau khi tiêm virus thử thách (61).

Các xét nghiệm tính hiệu lực trên các loài mục tiêu khác, như cừu, dê hay trâu thì hoặc là khác biệt hoặc là không được chuẩn. Thông thường, một xét nghiệm thành công trên bò được coi là đủ bằng chứng cho chất lượng của một vaccin đối với việc sử dụng vaccin này trên các loài khác. Trong các hoàn cảnh mà một vaccin được sản xuất để sử dụng chủ yếu cho một loài khác ngoài bò, xét nghiệm về tính hiệu lực thích hợp nhất là thực hiện trên loài mục tiêu. Đối với trâu Châu Phi hay Châu Á (Bubalus bubalis) và cừu, do tự nhiên thường không xuất hiện bệnh trên những loài này, các xét nghiệm tính hiệu lực có thể dựa vào chỉ số chất lượng của vaccin hơn là cố gắng thực hiện một xét nghiệm cho tính hiệu lực chỉ nhằm vào phát hiện các dấu hiệu lâm sàng trong những loài này.

Một giao thức thử nghiệm trên bò có thể được điều chỉnh đối với thử nghiệm vaccin FMD trên heo, sử dụng ba nhóm có năm heo (15 heo), không dưới 2 tháng tuổi và sạch khỏi các kháng thể trung hòa các chủng huyết thanh khác nhau của virus FMD. Một nhóm được cấp vaccin với liều lượng đủ cho heo theo khuyến cáo của nhà sản xuất, một nhóm nhận được liều lượng giảm, thí dụ ¼ liều, và nhóm thứ ba nhận được liều ít hơn, như 1/16 liều. Thông thường, đáp ứng với vaccin nhũ dầu thì cho phép phát triển lâu hơn, cho đến 28 ngày sau khi cấp vaccin, thì ba nhóm heo, cộng với hai heo đối chứng không cấp vaccin, mới được đem thử thách. Tuy nhiên, tùy theo công thức vaccin, khoảng thời gian này phải được giảm đi như đối với xét nghiệm trên bò. Điều quan trọng là các nhóm cấp vaccin với liều lượng khác nhau được tách riêng trong quá trình thử nghiệm và những con chú này được loại trừ càng sớm càng tốt khi chúng thể hiện phát triển FMD đặc trưng, để tránh phơi nhiễm quá mức đến các con thú còn lại. Thử thách bằng tiêm dưới biểu bì (intradermal) nơi mấu lồi gót chân (heel bulb) của một chân với 10.000 TCID₅₀ (0,2 ml), liều lượng này đã được tính toán bằng nuôi cấy một virus thử thách tương đồng với dòng virus sử dụng chế tạo vaccin, cấy vào tế bào nuôi cấy thích hợp lấy từ heo, và virus thử thách này cho ra bệnh đặc trưng trên heo. Cách khác, virus thử thách có thể được cấp vào một vị trí trong phần cơ cổ phía sau tai, sử dụng một liều lượng virus mà gây được bệnh đặc trưng theo đường này. Các con thú được quan sát hàng ngày trong 10 ngày sau khi thử thách, để phát hiện các dấu hiệu lâm sàng của FMD. Cả hai heo đối chứng đều phải phát triển các dấu hiệu lâm sàng trên hơn một chân. Từ số lượng các con thú đã được bảo hộ trong từng nhóm, hàm lượng PD₅₀ của vaccin được tính ra. Ở đây có các phương pháp khác nhau để tính toán PD₅₀ (31), bao gồm các phương pháp dựa vào Kärber. Vaccin này phải chứa ít nhất 3 PD₅₀ mỗi liều cho heo. Tương tự, một giao thức đối với thử nghiệm PGP trên bò có thể được điều chỉnh áp dụng trên heo, sử dụng một nhóm 16 con thú đã được cấp vaccin và hai con không được cấp vaccin làm đối chứng. Thử thách bằng tiêm dưới biểu bì nơi mấu lồi gót chân của một chân với 10.000 TCID₅₀ (0,2 ml) của một virus thử thách có độc lực mà tương đồng với dòng virus sử dụng chế tạo vaccin, mà virus thử thách này được biết là tạo được các dấu hiệu lâm sàng trên heo.

Các thử nghiệm gián tiếp, bao gồm đo lường sau khi cấp vaccin, về trung hòa các kháng thể trong tế bào nuôi cấy, hay xét nghiệm các kháng thể bằng ELISA, hay tiêm huyết thanh có kháng thể bảo hộ vào chuột non, đều có thể áp dung để đánh giá tính hiệu lực của một vaccin, với điều kiện là một đánh giá thống kê được thiết lập có đủ khả năng liên hệ giữa các kết quả thu được bởi thử nghiệm trên chủng huyết thanh của virus vaccin có liên quan với thử nghiệm tính hiệu lực trên bò (60). Thí dụ, tỷ lệ bảo hộ mong muốn được áp dụng để phân tích huyết thanh của một nhóm ít nhất 16 bò được cấp vaccin và để biểu diễn xác suất của một con thú được bảo hộ bằng đo lường các kháng thể trung hòa, ELISA hay kháng thể bảo hộ. Trong một nhóm thú vật mà cấp vaccin với liều lượng đầy đủ, tỷ lệ bảo hộ mong muốn phải tương đương hay lớn hơn 75% khi thử nghiệm trên 16 con thú, hoặc 70% khi thử nghiệm trên 30 con thú trong thực nghiệm.

Sự hiện diện của nhiều hơn một chủng huyết thanh trong một vaccin không hạn chế sản sinh các khác thể đối với chủng huyết thanh khác hay có liên quan về hiệu giá kháng thể bảo hộ.