c) Tính tinh khiết (Purity): xét nghiệm về kháng thể kháng các protein không cấu trúc

Ở mức độ lô, việc xác nhận tính tinh khiết của vaccin có thể thể hiện bằng chứng minh không có gia tăng phản ứng đối với các protein không cấu trúc trong huyết thanh từ các con thú đã được sử dụng trong thử nghiệm tính hiệu lực, huyết thanh thu được từ 30 ngày sau khi cấp vaccin lần đầu và trước khi thử thách, đem so sánh với huyết thanh của cùng con thú này trước khi cấp vaccin.

Để thiết lập mức độ đầy đủ của miễn dịch, người ta thường đưa ra một liệu trình ban đầu gồm hai lần cấp vaccin, từ 2-4 tuần trở đi, sau đó là tái chủng theo mỗi 4-12 tháng. Tần suất tái chủng sẽ tùy theo tình hình dịch tễ và dạng cùng với chất lượng vaccin sử dụng. Khi việc tiếp cận thú vật là khó khăn, thích hợp là sử dụng vaccin phụ gia nhũ dầu vào tháng tuổi thứ 4 và 1 năm tuổi, sau đó tái chủng ngừa hàng năm. Khi có thể, các nhà sản xuất vaccin phải chứng minh độ dài miễn dịch của công thức chuyên biệt của họ trong từng loài mà họ chỉ định.

Với bê sinh ra từ bò cái đã được cấp vaccin, lần chủng ngừa thứ nhất sẽ được trì hoãn đến mức có thể để cho phép cạn kiệt kháng thể mẹ truyền. Thời gian trì hoãn này phải không quá 4 tháng, vì ở lứa tuổi này, một tỷ lệ cao có thể được mong muốn để đáp ứng một cách hiệu quả đối với vaccin. Với bê sinh ra từ bò mẹ không được cấp vaccin, chủng ngừa lần đầu có thể được cấp sớm ngay từ 1 tuần tuổi, đối với một số loại vaccin (8).

e) Tính ổn định (Stability)

Thời gian tồn tại của một vaccin FMD bình thường là từ 1-2 năm ở 4^oC (giới hạn tối đa là 2-8^oC), nhưng vaccin không bền với nhiệt và không bao giờ được bảo quản ở đông đá lẫn trên nhiệt độ chuẩn 4^oC. Tính ổn định của tất cả các loại vaccin, nhất là các loại vaccin nhũ dầu, phải được chứng minh như một phần của các nghiên cứu xác định thời gian tồn tại, để được cấp phép.

Chất bảo quản thường được sử dụng nhất là chloroform và merthiolate. Merthiolate được sử dụng ở hàm lượng thành phẩm là 1/30.000 (w/v).

Các loại vaccin FMD hiện tại đều vọ hại và không thể hiện nguy cơ độc hại cho người sử dụng. Cần phải cẩn thận để tránh tự tiêm chích với loại vaccin nhũ dầu.

Khối kháng nguyên vaccin, các chất phụ gia, các chất đệm pha và thành phẩm tổng hợp đều phải trải qua xét nghiệm tính vô trùng. Điều này có thể thực hiện một cách trực tiếp với các thành phần của vaccin và thành phẩm, nhưng phương pháp thích hợp là thu thập mọi vi sinh vật vấy nhiễm bằng lọc qua màng lọc cho các chất liệu sẽ được kiểm tra và để phát hiện mọi vi sinh vật hiện diện bằng nuôi cấy các màng lọc bằng môi trường nuôi cấy. Phương pháp cấy màng lọc cho phép loại trừ các chất bảo quản… mà có thể cản trở việc phát hiện các vi sinh vật. Các hướng dẫn về kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, mà cho phép phát hiện phổ rộng các vi sinh vật, được nêu trong Dược điển Châu Âu 2008 (European Pharmacopoeia 2008) (27; cũng tham khảo Chương 1.1.9 Các xét nghiệm về tính vô trùng và sạch khỏi vấy nhiễm đối với chất liệu sinh học).

Xét nghiệm về tính vô hại là một xét nghiệm trong quá trình sản xuất, mà sẽ được thực hiện cho từng lô kháng nguyên. Sau quá trình làm bất hoạt, một mẫu của lô kháng nguyên đã được làm bất hoạt đại diện cho ít nhất 200 liều sẽ được đem xét nghiệm về sạch khỏi virus gây nhiễm, bằng cấy vào môi trường tế bào nuôi cấy đơn lớp, thích hợp là có cùng nguồn gốc như loại tế bào sử dụng cho sản xuất kháng nguyên. Có thể thích hợp là cô đậm kháng nguyên để xét nghiệm tính vô hại, trong trường hợp này phải cho thấy rằng chất liệu được cô đậm không ảnh hưởng độ nhạy hay khả năng đọc được xét nghiệm. Các phiến tế bào được kiểm tra hàng ngày trong suốt 3 ngày, sau đó môi trường cạn dinh dưỡng từ lớp tế bào này được cấy truyền sang các đơn lớp sạch mới và các tế bào nguồn được bổ sung thêm môi trường nuôi dưỡng sạch. Áp dụng phương pháp này, các dấu vết của virus có thể được khuếch đại bằng cấy truyền và được phát hiện dựa vào tác động gây bệnh tích tế bào. Thường áp dụng hai đến ba lần cấy truyền từ chế phẩm virus gốc. Một cải tiến của phương pháp này là đông lạnh-giải đông các đơn lớp cũ để phóng thích virus từ nội bào, mà có thể được phát hiện bằng cấy truyền thêm.

Xét nghiệm tính an toàn của lô thành phẩm được thực hiện bằng phát hiện bất kỳ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào. Xét nghiệm này cũng có thể xác nhận tính vô hại, nhưng không nhạy bằng các xét nghiệm ở ngoại môi trường như nêu trên. Với mục đích cho phát hành lô vaccin, từng con của ít nhất hai con bò khỏe mạnh có huyết thanh âm tính được cấy truyền theo đường được khuyến cáo cho cấp vaccin, với liều lượng gấp hai lần khuyến cáo của nhà sản xuất. Các con thú được quan sát về các phản ứng cục bộ và toàn thân đối với vaccin, trong thời gian không dưới 14 ngày. Nếu bất kỳ con thú nào có phát triển các dấu hiệu của FMD, thì lô vaccin này là không đạt với xét nghiệm tính an toàn. Tương tự, mọi độc tính quá mức ảnh hưởng đến vaccin phải được đánh giá và có thể cản trở việc chấp thuận lô vaccin. Một cách lý tưởng, các vaccin được chế tạo cho các loài khác ngoài bò cũng phải được xét nghiệm về tính an toàn trên loài mà vaccin hướng đến, cấp một liều vaccin gấp đôi liều lượng mà nhà sản xuất khuyến cáo theo đường cấp được khuyến cáo và theo thể tích của liều vaccin. Các con thú sẽ được kiểm tra hàng ngày trong đối thiểu 14 ngày về bằng chứng của độc tính hay các dấu hiệu của FMD.

Tính hiệu lực được kiểm tra trên sản phẩm thành phẩm (xem Đoạn D.5.b). Số lượng kháng nguyên sẽ được sử dụng như là một chỉ số gián tiếp về tính hiệu lực, với điều kiện là có một liên hệ trước được thiết lập giữa số lượng kháng nguyên, đáp ứng huyết thanh học và bảo hộ đối với thử thách, và với điều kiện là một xét nghiệm khác thích hợp cho đo lường đáp ứng huyết thanh học đối với quá trình miễn dịch đã được thực hiện mà có kết quả đảm bảo.

Các phương pháp về bảo quản các kháng nguyên cô đậm ở nhiệt độ siêu thấp để tổng hợp về sau này thành vaccin FMD, ngày nay đã trở thành chọn lựa phổ biến cho chế tạo vaccin. Điều này không chỉ trở thành cơ sở cho bảo quản các kháng nguyên trong một chiến lược dự trữ dùng cho các mục đích khẩn cấp (xem Chương 1.1.10 Các hướng dẫn về các Tiêu chuẩn Quốc tế đối với các Ngân hàng Vaccin), mà còn cho phép nhà sản xuất tiếp cận ngay đến các dòng kháng nguyên khác nhau mà có thể tổng hợp thành vaccin một cách nhanh chóng và phân phối đến nơi tiêu thụ. Dự trữ này làm giảm việc trì hoãn các đơn hàng, đặc biệt khi có yêu cấu đối với các vaccin đa giá. Một lợi thế khác của phương pháp này là xét nghiệm về chất lượng có thể đảm bảo cho việc xuất khẩu.

Cần phải nhớ rằng những kháng nguyên này đã được kiểm soát bằng áp dụng các tiêu chuẩn đã nêu trong Đoạn D.1-4.

Phải chú ý đặc biệt đến:

- sự sạch khỏi các tác nhân ngoại lai;

Các kháng nguyên phải chứng minh là sạch khỏi các tác nhân ngoại lai như liệt kê bởi cấp thẩm quyền cấp phép.

- độ nhạy của lớp tế bào sử dụng để phát hiện virus tồn dư;

Các tế bào được sử dụng để xét nghiêm virus sống tồn dư là không thích hợp nếu sử dụng một lượng virus tương ứng 1 µg của kháng nguyên 146S mà cho ra hiệu giá dưới 10⁶ TCID₅₀ (27).

- các biện pháp khẩn cấp đối với điều khoản chấp nhận của Giống Virus Gốc (Master Seed Virus – MSV), và hậu quả phát hành các vaccin đã tổng hợp.

Trong trường hợp về sự xâm nhập của một dòng virus mới mà có tính kháng nguyên khác với dòng virus vaccin hiện hành, thì có thể cần phải phát triển một dòng vaccin mới từ một đại diện phân lập từ thực địa. Trước khi giống virus gốc mới có thể được chấp thuận, phải chứng minh được sự tuân thủ đầy đủ các hướng dẫn để chứng minh về sạch khỏi mọi tác nhân ngoại lai được liệt kê bởi cấp phép, sử dụng cả các xét nghiệm thông thường lẫn các xét nghiệm đặc biệt, và để thiết lập tính tương đồng đối với dòng phân lập ứng viên. Thời gian cần thiết có thể bị kéo dài, để tạo ra kháng huyết thanh đặc hiệu, sử dụng cho các xét nghiệm thông thường về trung hòa dòng virus mới, để phát hiện ra các tác nhân ngoại lai, và để thực hiện các xét nghiệm đặc trưng khác mà yêu cầu các kỹ thuật đặc biệt. Do đó, trong các tình hình khẩn cấp, khi mà không đủ thời gian để hoàn tất xét nghiệm đầy đủ với virus giống gốc, điều khoản chấp nhận về dòng virus mới phải dựa vào một phân tích nguy cơ về khả năng vấy nhiễm các tác nhân ngoại lai trong kháng nguyên được chế tạo từ virus giống gốc mới. Đánh giá nguy cơ này phải dự tính rằng phương pháp đã được đánh giá nhằm làm bất hoạt virus phải được áp dụng khi thiết lập virus giống gốc và virus là được bất hoạt bằng hóa chất một cách dễ dàng. Các đảm bảo thêm được dự tính bằng yêu cầu quá trình làm bất hoạt phải được theo dõi và được ghi nhận đối với từng lô sản xuất.

Để thúc đẩy nhanh việc phát hành các lô vaccin đã được tổng hợp có chứa các dòng virus vaccin mới, có thể chấp nhận đối với xét nghiệm tính hiệu lực theo lô, sẽ được thực hiện bằng sử dụng một vaccin được tổng hợp ngay từ kháng nguyên đại diện cho kháng nguyên dùng cho sản xuất tất cả các lô kháng nguyên mà có hướng làm thành phẩm. Điều này sẽ cho phép có được tính hiệu lực của kháng nguyên lấy từ một giống virus gốc sẽ được xác định, trong khi nhà sản xuất vẫn tiếp tục nhân giống cho kháng nguyên mới này.

Cơ sở vật chất (Facilities)

Quan trọng là tất cả mọi phương diện về bảo quản kháng nguyên cô đậm là tuân thủ đầy đủ đối với các tiêu chuẩn được quốc tế chấp nhận của Thực hành Sản xuất Tốt (Good Manufacturing Practice).

Tích trữ (containment) đối với các kháng nguyên bảo quản

Các số lượng liều lượng hay các thể tích được bảo quản là điều quan tâm quan trọng, đặc biệt là khi có bảo quản chia sẻ giữa các Quốc gia Thành viên và ở đây có các biến thiên về số lượng các liều lượng cần đến bởi từng thành viên trong tình hình khẩn cấp. Có thể là thuận tiện khi bảo quản các số lượng kháng nguyên cô đậm trong các đơn vị thuận tiện sử dụng (user-friendly units) để cho phép sử dụng tốt hơn không gian dự trữ và cho khả năng sản xuất ra những lô vaccin nhỏ hơn. Các vật chứa dung tích từ 1 đến 2 lít có thể đáp ứng cho hơn 30.000 liều vaccin bò. Khi có yêu cầu đối với dự trữ lớn của một dòng virus vaccin đặc biệt mà chi có thể được sản xuất thành vài đợt thành phẩm, các quản lý ngân hàng vaccin phải cân nhắc sự cần thiết cả về tổng hợp từng lô thành một phối trộn thành phẩm đại diện cho mục đích xét nghiệm hay trộn thành từng lô riêng biệt, ở một số thời điểm thích hợp, để dễ dàng cho tổng hợp công thức và/hoặc xét nghiệm.

Dạng vật chứa sử dụng để giữ kháng nguyên cô đậm là điều quan trọng. Dưới các điều kiện nhiệt độ siêu thấp, việc sử dụng các vật chứa làm bằng các vật liệu mà không bị giòn gãy, thí dụ tốt là fluoropolymer dập khuôn dạng chai. Chất polyfluoro-alkoxy (PFA) dập khuôn thành chai, có khả năng chịu được nhiệt độ từ - 270^oC đến +250^oC.

Tạo nhãn cho các kháng nguyên bảo quản

Mặc dù ở đây có các hướng dẫn của quốc gia và quốc tế về yêu cầu đối với nhãn hiệu của các chế phẩm dược thú y, ở đây không có những hướng dẫn cho các chất liệu bảo quản ngay như thành phần kháng nguyên của vaccin, do đó cốt yếu là hướng đến các vấn đề như đối với chất liệu “trong sản xuất”. Dưới các điểu kiện nhiệt độ cực thấp, phương pháp tạo nhãn phải có tính bền bỉ. Theo kinh nghiệm, các chai được đeo thẻ là chọn lựa thích hợp nhất, sử dụng thẻ kim loại kích thước đủ cho các chi tiết cần thiết. Những chi tiết này phải bao gồm dòng kháng nguyên/virus vaccin, số lô, ngày tiếp nhận và cũng phải bao gồm số hiệu của vật chứa hay số hiệu của chất liệu chứa. Thông tin thể hiện phải rõ ràng để đọc và lập trên thẻ bằng dùng mực không phai. Các thẻ nhôm đã được sử dụng cho mục đích này và được sơn phủ các màu khác nhau cho phép phân biệt, đặc biệt khi các dòng kháng nguyên khác nhau được chứa trong cùng một kho. Thẻ kim loại cũng cho phép thông tin được khắc vào vĩnh viễn.

Theo dõi

Quan trọng thực tế là các kháng nguyên cô đậm được duy trì một cách tối ưu và được theo dõi với thủ tục để có một số đảm bảo rằng chúng sẽ có hiệu quả khi sử dụng đến. Do đó, việc bố trí phải được thiết lập để theo dõi các kháng nguyên cô đậm này trên một thủ tục cơ bản và để nếu cần, vào các khoảng thời gian thích hợp, có chế độ xét nghiệm để đảm bảo tính nguyên vẹn của thành phần kháng nguyên hay tính hiệu lực có thể chấp nhận được của thành phẩm. Thí dụ, việc theo dõi nhiệt độ bảo quản bình thường được thực hiện và ghi chép trong các ngân hàng vaccin FMD, cũng như kiểm tra định kỳ các chai chứa kháng nguyên về nứt vở hay rò rỉ. Tùy theo dạng, thể tích và cách thức bảo quản, có thể đánh giá bằng cân lượng các kháng nguyên được bảo quản để đảm bảo rằng không bị trở nên tiềm sinh (lyophilise). Một số ngân hàng vaccin FMD có kết hợp với các xét nghiệm sinh hóa như các phân tích mật độ sucrose, để theo dõi tính nguyên vẹn của virus và cả tính ổn định, và cũng nhân đó thực hiện các xét nghiệm ở nội môi trường. Tuy nhiên, do nhận thấy rằng thời gian tồn tại của các kháng nguyên FMD cô đậm có thể kéo dài trên 15 năm khi bảo quản dưới nhiệt độ cực thấp, một tiếp cận sinh hóa được coi là đủ đảm bảo.

Sau đây là các xét nghiệm được đề xuất là thích hợp cho đánh giá và tái đánh giá các kháng nguyên dự trữ.

** Trong một xét nghiệm rút gọn, tất cả các thú vật trong nhóm thể tích chia nhỏ tiếp theo được giả thiết là không có bảo hộ. Do đó xét nghiệm này cho ra giá trị PD₅₀ thấp một cách chủ quan, nhưng giảm được số lượng thú vật cần thiết.

Để đáp ứng được các yêu cầu xét nghiệm đối với kháng nguyên dự trữ, các đậm độ phải bao gồm một số mẫu nhỏ mà đại diện cho khối dự trữ lớn. Các lượng nhỏ của kháng nguyên FMD đại diện thường gồm thể tích chứa khoảng một milligram kháng nguyên.

THAM KHẢO

1. ADAMOWICZ PH., LEGRAND B., GUERCHE J. & PRUNET P. (1974). Un nouveau procedé de concentration et de purification du virus. Application du virus de la fièvre aphteuse produit sur cellules BHK21 pour l’obtention des vaccins hautement purifiés. Bull. OIE, 81, 1125–1150.

2. ALEXANDERSEN S., ZHANG Z., REID S.M., HUTCHINGS G.H., DONALDSON A.I. (2002). Quantities of infectious virus and viral RNA recovered from sheep and cattle experimentally infected with foot-and-mouth disease virus O UK 2001. J. Gen. Virol., 83 (8), 1915–1923.

3. ALONSO F.A. (1986). Manual de Diagnostico de Laboratorio de las Enfermadedas Vesiculares, Panaftosa.

4. ALONSO F.A., CASAS OLASCOAGA R.C., ASTUDILLO V.M., SONDAHL M.S., GOMES I. & VIANNA FILHO Y.L. (1987). Updating of foot-and-mouth disease virus strains of epidemiological importance in South America. Bol. Centr. Panam. Fiebre Aftosa, 53, 11–18.

5. ALONSO A., GOMES M.D., RAMALHO A.K., ALLENDE R., BARAHONA H., SONDHAL M. & OSÓRIO F. (1993). Characterization of foot-and-mouth disease vírus by monoclonal antibodies. Viral Immunol., 6 (3), 219–228.

6. ALONSO A., MARTINS M.A., GOMES D.M.P., ALLENDE R. & SONDAHL M.S. (1992). Foot-and-mouth disease virus typing by complement fixation and enzyme-linked immunosorbent assay using monovalent and polyvalent antisera. J. Vet. Diagn. Invest., 4, 249–253.

7. AMAREL-DOEL C.M.F., OWEN N.E., FERRIS N.P., KITCHING R.P. & DOEL T.R. (1993). Detection of foot-andmouth disease viral sequences in clinical specimens and ethyleneimine-inactivated preparations by the polymerase chain reaction. Vaccine, 11, 415–421.

8. AUGE DE MELLO P., GOMES I. & BAHNEMANN H.G. (1989). The vaccination of young cattle with an oil adjuvant foot-and-mouth disease vaccine. Bol. Centr. Panam. Fiebre. Aftosa, 55, 3–14.

9. BAHNEMANN H.G. (1975). Binary ethyleneimine as an inactivant for foot-and-mouth disease virus and its application for vaccine production. Arch. Virol., 47, 47–56.

10. BAHNEMANN H.G. (1990). Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine. Vaccine, 8, 299–303.

11. BARNETT P.V., PULLEN L., WILLIAMS L. & DOEL T.R. (1996). International bank for foot-and-mouth disease vaccine: assessment of Montanide ISA 25 and ISA 206, two commercially available oil adjuvants. Vaccine, 14, 1187–1198.

12. BARTELING S.Z. & VREESWIJK Z. (1991). Developments in foot-and-mouth disease vaccines. Vaccine, 9, 75– 88.

13. BASTOS A.D.S. (1998). Detection and characterization of foot-and-mouth disease virus in sub-Saharan Africa. Onderstepoort J. Vet. Res., 65, 37–47.

14. BERGMANN I.E., MALIRAT V., NEITZERT E., PANIZUTTI N., SANCHEZ C. & FALCZUK A. (2000). Improvement of serodiagnostic strategy for foot and mouth disease virus surveillance in cattle under systematic vaccination: a combined system of an indirect ELISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot. Arch. Virol., 145, 473–489.

15. BERGMANN I.E., NEITZERT E., MALIRAT V., ORTIZ S., COLLING A., SANCHEZ C. & CORREA MELO E. (2003). Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay and its use as an epidemiological indicator of foot-and-mouth disease viral activity. Arch. Virol., 148, 891–901.

16. BERGMANN I.E., TIRABOSCHI B., MAZZUCA G., FERNANDEZ E., MICHAILHOFF C.A., SCODELER E. & LA TORRE J.L. (1988). Serological and biochemical analysis of foot-and-mouth disease virus (serotypeC3) isolated in Argentina between 1981 and 1986. Vaccine, 6, 245.

17. BROCCHI E., BERGMANN I.E., DEKKER A., PATON D.J., SAMMIN D.J., GREINER M., GRAZIOLI S., DE SIMONE F., YADIN H., HAAS B., BULUT N., MALIRAT V., NEITZERT E., GORIS N., PARIDA S., SORENSEN K. & DE CLERCQ K. (2006). Comparative evaluation of six ELISAs for the detection of antibodies to the non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus. Vaccine (submitted).

18 CALLAHAN J.D., BROWN F., CSORIO F.A., SUR J.H., KRAMER E., LONG G.W., LUBROTH J., ELLIS S.J., SHOULARS K.S., GAFFNEY K.L., ROCK D.L. & NELSON W.M. (2002). Use of a portable real-time reverse transcriptasepolymerase chain reaction assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus J. Am. Vet. Med. Assoc., 220 (11), 1636–1642.

19. CLARKE J.B. & SPIER R.E. (1980). Variation in the susceptibility of BHK populations and cloned cell lines to three strains of foot-and-mouth disease virus. Arch. Virol., 63, 1–9.

20. DE DIEGO M., BROCCHI E., MACKAY D. & DE SIMONE F. (1997). The use of the non-structural polyprotein 3ABC of FMD virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle. Arch. Virol., 142, 2021–2033.

21. DOEL T.R. & BACCARINI P.J. (1981). Thermal stability of FMDV. Arch. Virol., 70, 21–32.

22. DOEL T.R. & COLLEN T. (1982). Qualitative assessment of 146S particles of FMDV in preparations destined for vaccines. J. Biol. Stand., 10, 69–81.

23. DOEL T.R., FLETTON B. & STAPLE R.F. (1982). Further developments in the quantification of small RNA viruses by UV photometry of sucrose density gradients. Dev. Biol. Stand., 50, 209–219.

24. DOEL T.R. & PULLEN L. (1990). International bank for foot-and-mouth disease vaccines: stability studies with virus concentrates and vaccines prepared from them. Vaccine, 8, 473–478.

25. DOEL T.R. & STAPLE R.F. (1982). The elution of FMDV from vaccines adjuvanted with aluminium hydroxide and with saponin. J. Biol. Stand., 10, 185–195.

26. DOEL T.R., WILLIAMS L. & BARNETT P.V. (1994). Emergency vaccination against foot-and-mouth disease. The rate of development of immunity and its implications for the carrier state. Vaccine, 12, 592–600.

27. EUROPEAN PHARMACOPOEIA (2008). Version 6.1. Monograph No. 63. Editions of the Council of Europe, Strasbourg, France.

28. FERRIS N.P. & DAWSON M. (1988). Routine application of enzyme-linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot-and-mouth and swine vesicular disease. Vet. Microbiol., 16, 201–209.

29. FERRIS N.P. & DONALDSON A.I. (1992). The World Reference Laboratory for Foot and Mouth Disease: a review of thirty-three years of activity (1958–1991). Rev. sci. tech. Off. int. epiz., 11 (3), 657–684.

30. FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO) (1984). Emerging Diseases of Livestock. Vol. 1. The Diseases and their Diagnosis, Geering W.A., ed. FAO, Rome, Italy, 43–51.

31. FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO) (1997). Potency assessment of inactivated viral vaccines. In: FAO Animal Production and Health Series No 35. Vaccine Manual. The Production and Quality Control of Veterinary Vaccines for use in Developing Countries, Mowat N. & Rweyemamu M., eds. FAO, Rome, Italy, 395–409.

32. GOLDING S.M., HEDGER R.S., TALBOT P. & WATSON J. (1976). Radial immunodiffusions and serum neutralisation techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease. Res. Vet. Sci., 20, 142–147.

33. GORIS N. & DE CLERCQ K. (2005). Quality assurance/quality control of foot and mouth disease solid phase competition enzyme-linked immunosorbent assay – Part I. Quality assurance: development of secondary and working standards. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 24 (3), 995–1004.

34 GORIS N. & DE CLERCQ K. (2005). Quality assurance/quality control of foot and mouth disease solid phase competition enzyme-linked immunosorbent assay – Part II. Quality control: comparison of two charting methods to monitor assay performance. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 24 (3), 1005–1016.

35. HAMBLIN C., BARNETT I.T.R. & HEDGER R.S. (1986). A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J. Immunol. Methods, 93, 115–121.

36. HAMBLIN C., KITCHING R.P., DONALDSON A.I., CROWTHER J.R. & BARNETT I.T.R. (1987). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. 3. Evaluation of antibodies after infection and vaccination. Epidemiol. Infect., 99, 733–744.

37. HERBERT W.J. (1965). Multiple emulsions. A new form of mineral-oil antigen adjuvant. Lancet, II, 771. 38. KÄRBER G. (1931). Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche. Archive für Experimentelle Pathologie Pharmakologie, 162, 480–483.

39. KITCHING R.P. & DONALDSON A.I. (1987). Collection and transportation of specimens for vesicular virus investigation. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 6, 263–272.

40. KITCHING R.P., RENDLE R. & FERRIS N.P. (1988). Rapid correlation between field isolates and vaccine strains of foot-and-mouth disease virus. Vaccine, 6, 403–408.

41. MACKAY D.K., BULUT A.N., RENDLE T., DAVIDSON F. & FERRIS N.P. (2001). A solid-phase competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus. J. Virol. Methods, 97 (1–2), 33–48.

42. MACKAY D.K.J, FORSYTH M.A., DAVIES P.R., BERLINZANI, A., BELSHAM G.J., FLINT M. & RYAN M.D. (1997). Differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease using a panel of recombinant, nonstructural proteins in ELISA. Vaccine, 16, 446–459.

43. MCCULLOUGH K.C., DE SIMONE F., BROCCHI E., CAPUCCI L., CROWTHER J.R. & KIHM U. (1992). Protective immune response against foot-and-mouth disease. J. Virol., 66 (4), 1835–1840.

44. MINISTRY OF AGRICULTURE, FISHERIES AND FOOD (1986). Foot-and-mouth disease. Ageing of lesions. Her Majesty’s Stationery Office, London, UK.

45. NEIZERT E., BECK E., AUGE DE MELLO P., GOMES I. & BERGMANN I.E. (1991). Expression of the aphthovirus RNA polymerase gene in Escherichia coli and its use together with other bioengineered non-structural antigens in detection of lager persistent infections. Virology, 184, 799–804.

46. PAIBA G.A., ANDERSON J., PATON D.J., SOLDAN A.W., ALEXANDERSEN S., CORTEYN M., WILSDEN G., HAMBLIN P., MACKAY D.K. & DONALDSON A.I. (2004). Validation of a foot-and-mouth disease antibody screening solidphase competition ELISA (SPCE). J. Virol. Methods, 115, 145–158.

47. PANAFTOSA (PAN-AMERICAN FOOT-AND-MOUTH DISEASE CENTER) (2001). Final recommendations of the Seminario internacional de Control de Vacuna Antiaftosa, Panaftosa, Rio de Janeiro, Brazil, 10– 14 September.

48. PATON D.J., VALARCHER J.-F., BERGMANN I., MATLHO O.G., ZAKHAROV V.M., PALMA E.L. & THOMSON G.R. (2005). Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains – a review. Rev. sci. tech. Off. int. epiz., 24, 981–993.

49. PEREIRA H.G. (1977). Subtyping of foot and mouth disease virus. Dev. Biol. Stand., 35, 167–174.

50. REID S., FERRIS N.P., HUTCHINGS G.H., SAMUEL A.R & KNOWLES N.J. (2000). Primary diagnosis of foot-andmouth disease by reverse transcription polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 89, 167–176.

51. REID S., FERRIS N.P., HUTCHINGS G.H., ZHANG Z., BELSHAM G.J., ALEXANDERSEN S. (2001). Diagnosis of footand- Mouth disease by real-time fluorogenic PCR assay. Vet. Rec., 149, 621–623.

52. REID S. M., GRIERSON S.S., FERRIS N.P., HUTCHINGS G H. & ALEXANDERSEN S. (2003). Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. Methods, 107 (2), 129–139.

53. ROEDER P.L. & LE BLANC SMITH P.M. (1987). The detection and typing of foot-and-mouth disease virus by enzyme-linked immunosorbent assay: a sensitive, rapid and reliable technique for primary diagnosis. Res. Vet. Sci., 43, 225–232.

54. RWEYEMAMU M.M. (1984). Antigenic variation in foot-and-mouth disease: studies based on the virus neutralization reaction. J. Biol. Standards, 12 (3), 323–337.

55. RWEYEMAMU M.M., BOOTH J.C., HEAD M.M. & PAY T.W.F. (1978). Microneutralisation tests for serological typing of foot and mouth disease virus strains. J. Hyg., 8, 107–102.

56. RWEYEMAMU M.M. & HINGLEY P.J. (1984). Foot and mouth disease virus strain differentiation: analysis of the serological data. J. Biol. Stand., 12, 225–229.

57. SAMUEL A.R., OULDRIDGE E.J., ARROWSMITH A.E.M., KITCHING R.P. & KNOWLES N.J. (1990). Serological analysis of type O isolates of FMD from the Middle East 1981–88. Vaccine, 8, 390–395.

58. SKINNER H.H. (1960). Some techniques for producing and studying attenuated strains of the virus of foot and mouth disease. Bull. OIE, 53, 634–650.

59. SORENSEN K.J., MADSEN K.G., MADSEN E.S., SALT J.S., NQUINDI J. & MACKAY D.K.J. (1998). Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and 3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch. Virol., 143, 1461–1476.

60. STREBEL K., BECK E., STROHMAIER D. & SCHALLER H. (1986). Characterisation of foot-and-mouth disease virus gene products with antisera against bacterially synthesised fusion proteins. J. Virol., 57, 983–991.

61. VIANNA FILHO Y.L., ASTUDILLO V., GOMES I., FERNANDEZ G., ROZAS C.E.E., RAVISON J.A. & ALONSO A. (1993). Potency control of foot-and-mouth disease vaccine in cattle. Comparison of the 50% protective dose and protection against generalisation. Vaccine, 11–14, 1424–1428.

62. WAGNER G.G., CARD J.L. & COWAN K.M. (1970). Immunochemical studies of foot-and-mouth disease virus. VII. Characterization of foot-and-mouth disease virus concentrated by polyethylene glycol precipitation. Arch. Ges. Virusforsch., 30, 343–352.