Bệnh lở mồm long móng (fmd) là bệnh truyền lây mạnh nhất của thú có vú và có khả năng gây ra tổn thất kinh tế nặng nề trên chăn nuôi gia súc móng guốc mẫn cảm


o Xét nghiệm cố định bổ thể (Complement fixation test)



tải về 387.03 Kb.
trang2/5
Chuyển đổi dữ liệu14.08.2016
Kích387.03 Kb.
#20005
1   2   3   4   5

o Xét nghiệm cố định bổ thể (Complement fixation test)

Thông thường, ELISA là thích hợp đối với xét nghiệm cố định bổ thể (CF) vì có độ nhạy hơn và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tiền hay kháng bổ thể. Nếu các tác nhân thử của ELISA là không sẵn có, xét nghiệm CF có thể thực hiện như sau:

Kháng huyết thanh của từng chủng của bảy chủng virus FMD được pha trong dịch đệm veronal (veronal buffer diluent – VBD) trong các bước pha loãng 1,5 lần từ độ pha loãng ban đầu 1/16 để lấy 25 µl các độ pha loãng của kháng huyết thanh trong các giếng có đáy hình chữ U trên một phiến vi hiệu giá. Thêm vào các giếng này 50 µl bổ thể 3 đơn vị quốc tế, tiếp theo thêm 25 µl (các) huyễn dịch mẫu xét nghiệm. Hệ thống xét nghiệm này được ủ ở 37oC torng 1 giờ trước khi thêm 25 µl hồng cầu cừu đã được chuẩn độ 1,4% (standardised sheep red blood cells (SRBC) trong VBD được làm tăng nhạy bằng 5 đơn vị quốc tế của huyết thanh thỏ kháng SRBC. Các tác nhân thử này được ủ ở 37oC thêm 30 phút và các phiến này sau đó được ly tâm và đọc. Các đối chứng thích hợp để xét nghiệm (các) huyễn dịch mẫu xét nghiệm, kháng huyết thanh, các tế bào và bổ thể được kết hợp. Các hiệu giá CF được biểu diễn là mẫu số của độ pha loãng huyết thanh tạo nên dung huyết 50%. Một hiệu giá CF ≥36 được coi là phản ứng dương tính. Các giá trị hiệu giá từ 24 phải được xác nhận bằng xét nghiệm lại kháng nguyên mà đã được khuyếch đại qua cấy truyền trên mô nuôi cấy.

c) Các phương pháp nhận ra acid nucleic

RT-PCR có thể được sử dụng để khuyếch đại các đoạn gen di truyền của virus FMD trong các chất liệu chẩn đoán, bao gồm biểu bì, sữa, huyết thanh và các mẫu OP (7, 13). RT kết hợp với PCR thời gian thực (real-time PCR) có độ nhạy tương đương với phân lập virus (2, 51) và các phương pháp tự động hóa làm gia tăng công suất xử lý mẫu (52). Các đoạn mồi đặc hiệu đã được thiết kế để phân biệt từng chủng của bảy chủng virus FMD. Kỹ thuật lai ghép ở phòng thí nghiệm (in situ) đã được phát triển để điều tra sự hiện diện RNA của virus FMD trong các mẫu mô (63). Những kỹ thuật này chỉ áp dụng trong các phòng thí nghiệm chuyên môn, tuy nhiên các hệ thống đơn giản hóa cho khả năng áp dụng trên thực địa đang được phát triển (18).

Điện di keo agarose dựa vào xét nghiệm RT-PCR (Agarose gel-based RT-PCR assay)

Phương pháp được áp dụng ở Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE tại Pirbright đã được mô tả (50). Xét nghiệm RT-PCR gồm ba phương pháp thành công của i) chiết xuất của khuôn mẫu RNA từ xét nghiệm hay mẫu đối chứng tiếp theo với ii) RT của RNA đã được chiết xuất, iii) quá trình khuyếch đại PCR của sản phẩm RT và iv) quá trình phát hiện các sản phẩm PCR bằng điện di chất keo agarose (agarose gel electrophoresis).



Phương pháp xét nghiệm

  1. Pha 200 µl mẫu xét nghiệm vào 1 ml TRIzol® Reagent trong một ống vô trùng. Bảo quản ở -70oC cho đến khi cần cho chiết xuất RNA.

  2. Chuyển 1 ml dung dịch từ bước i. vào một ống sạch, vô trùng chứa 200 µl chloroform. Trộn đều trong khoảng 10-15 giây và để ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.

  3. Ly tâm trong 15 phút ở 20.000 g.

  4. Chuyển 500 µl dạng lỏng này vào một ống sạch, vô trùng có chứa 1 µl glycogen (20 mg/ml) và thêm 500 µl iso-propyl-alcohol (propan-2-ol). Trộn đều trong vài giây.

  5. Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó ly tâm trong 10 phút ở 20,000 g.

  6. Đổ bỏ dịch phù nổi trong ống và thêm 1 ml ethanol 70%. Trộn hỗn hợp này trong vài giây.

  7. Ly tâm trong 10 phút ở 20.000 g.

  8. Cẩn thận loại bỏ dịch phù nổi khỏi ống, cẩn thận để không làm tróc hay mất đi bất kỳ phần nào của phần lắng ở đáy ống.

  9. Để khô ống ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút.

  10. Tái hợp nước cho trầm lắng bằng thêm vào trong ống 20 µl nước có nuclease tự do (nuclease- free water).

  11. Để các mẫu chiết xuất RNA trong nước đá nếu bước RT sắp tiến hành. Nếu không thì bảo quản ở -70oC.

  12. Với mỗi mẫu sẽ được kiểm tra, thêm 2 µl random hexamer (20µg/ml) và 5 µl nước có nuclease tự do vào một ống tiểu ly tâm dung tích 0,5 ml. Khuyên rằng chuẩn bị đủ số lượng dịch pha chung một lần cho tổng số lượng các mẫu sẽ được kiểm tra, cộng dư thêm một lượng của một mẫu nữa.

  13. Thêm 5 µl RNA từ công đoạn chiết xuất đã nêu trên để cho ra thế tích là 12 µl trong từng ống. Trộn bằng cách nhẹ nhàng đưa ống hút di chuyển lên xuống.

  14. Ủ ở 70oC trong 5 phút.

  15. Để nguội ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

  16. Trong thời gian ủ 10 phút, chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng RT như được nêu dưới đây cho từng mẫu. Chuẩn bị tổng số lượng hỗn hợp phản ứng trong một ống tiểu ly tâm dung tích 1,5 ml cho toàn bộ số lượng mẫu đem kiểm tra với cộng dư thêm một lượng của một mẫu.

Đệm cho đoạn đầu, 5 x chuỗi (4µl); albumin huyết thanh bò (đã acetyl hóa – acetylated), 1mg/ml (2 µl); dNTPs, 10mM hỗn hợp của mỗi dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1 µl); DTT, 1 M (0.2 µl); Moloney Murine Reverse Transcriptase, 200 U/ µl (1 µl).

  1. Thêm 8 µl hỗn hợp phản ứng vào 12 µl của đoạn mồi ngẫu nhiên/hỗn hợp RNA. Trộn bằng khuấy nhẹ nhàng ống hút.

  2. Ủ ở 37oC trong 45 phút.

  3. Giữ các sản phẩm RT trong nước đá nếu bước khuếch đại sắp tiến hành, nếu không bảo quản ở -20oC.

  4. Chuẩn bị hỗn hợp PCR như được nêu dưới đây cho từng mẫu. Khuyên rằng chuẩn bị tổng số lượng hỗn hợp một lần đủ cho các mẫu sẽ kiểm tra với cộng dư thêm cho một mẫu.

Nước có nuclease tự do (nuclease-free water) (35 µl); đệm cho phản ứng PCR, 10× chuỗi (5 µl); MgCl2, 50 mM (1.5 µl); dNTPs, 10 mM hỗn hợp của từng dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1 µl); đoạn mồi 1, 10 pmol/µl (1 µl); đoạn mồi 2, 10 pmol/µl (1 µl); Taq Polymerase, 5 đơn vị quốc tế/µl (0.5 µl).

  1. Thêm 45 µl hỗn hợp phản ứng PCR vào một giếng của phiến PCR hay vào một ống tiểu ly tâm cho từng mẫu sẽ được kiểm tra, sau đó cho 5 µl sản phẩm RT để cho ra thế tích phản ứng cuối cùng là 50 µl.

  2. Đảo xoay đều phiến hay ống trong 1 phút để trộn đều chất chứa của từng giếng.

  3. Đặt phiến này vào một máy gia nhiệt chu kỳ để khuếch đại PCR và đặt chương trình như sau:

94°C trong 5 phút: 1 chu kỳ;

94°C trong 1 phút, 55°C trong 1 phút, 72°C trong 2 phút: 30 chu kỳ;

72°C trong 7 phút: 1 chu kỳ.


  1. Trộn 20 µl dịch lỏng của từng sản phẩm phản ứng PCR với 4 µl dung dịch màu và nạp vào keo agarose 1,5%. Sau khi điện di, một kết quả dương tính chỉ thị bằng thể hiện dải 328 bp tương ứng với kết chuỗi của virus FMD trong vùng 5’ không giải mã của gen di truyền.

Các dung dịch dự trữ (stock solutions)

  1. Nước có nuclease tự do (nuclease-free water), TRIzol® Reagent, chloroform, glycogen, iso-propyl-alcohol (propan-2-ol), ethanol, các đoạn mồi hexanucleotide ngẫu nhiên, đệm chuỗi ban đầu (first strand buffer), BSA (đã acetyl hóa – acetylated), dNTPs, DTT, Moloney Murine Reverse Transcriptase, đệm phản ứng PCR (10×), MgCl2Taq Polymerase, đều sẵn có trên thị trường.

  2. Các đoạn mồi ở hàm lượng 10 pmol/µl: Kết chuỗi đoạn mồi 1: 5’-GCCTG-GTCTT-TCCAG-GTCT-3’ (kết sợi dương); Kết chuỗi đoạn mồi 2: 5’-CCAGT-CCCCT-TCTCA-GATC-3’ (kết sợi âm).

Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực (real-time RT-PCR assay)

Phương pháp này được áp dụng tại Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE tại Pirbright. Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực cũng thực hiện chiết xuất RNA từ mẫu đối chứng hay mẫu xét nghiệm, sau đó bằng RT của RNA đã chiết xuất như với phương pháp điện di keo agarose thông thường. Quá trình chiết xuất tự động toàn bộ acid nucleic từ các mẫu kèm theo máy hút tự động cho các bước RT và PCR (52) có thể được áp dụng thay thế cho các thao tác cơ bản nêu trên. Quá trình khuếch đại PCR của sản phẩm RT được tiếp theo bằng một thao tác khác. Việc nhận diện các sản phẩm PCR trong keo agarose là không cần thiết sau quá trình khuếch đại thời gian thực.



  1. Lấy các sản phẩm RT từ bước xix (xem dưới đây).

  2. Chuẩn bị hỗn hợp PCR như mô tả dưới đây cho từng mẫu. Cũng khuyên rằng chuẩn bị tổng số lượng hỗn hợp đủ cho toàn bộ mẫu xét nghiệm cộng thêm số dư cho một mẫu: nước chứa nuclease tự do (nuclease-free water) (6µl); hỗn hợp chính phản ứng PCR (PCR reaction master mix), chuỗi 2x (12,5 µl); đoạn mồi trở đi của PCR thời gian thực (real-time PCR forward primer), 10 pmol/µl (2,25 µl); đoạn mồi đảo ngược PCR thời gian thực (real-time PCR reverse primer), 10 pmol/µl (2,25 µl); thăm dò TaqMan® (TaqMan® probe), 5 pmol/µl (1 µl).

  3. Thêm 24 µl hỗn hợp phản ứng PCR vào một giếng của phiến PCR thời gian thực cho từng mẫu sẽ được kiểm tra, sau đó cho 1 µl sản phẩm RT để cho ra thế tích khối phản ứng cuối cùng là 25 µl.

  4. Lắc đều phiến torng 1 phút bằng máy lắc để trộn chất chứa của từng giếng.

  5. Đặt phiến vào máy PCR thời gian thực cho khuếch đại PCR và chạy theo chương trình:

50°C trong 2 phút: 1 chu kỳ;

95°C trong 10 phút: 1 chu kỳ;

95°C trong 15 giây, 60°C trong 1 phút: 50 chu kỳ.


  1. Đọc các kết quả: Xác định một giá trị chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – CT) cho từng phản ứng PCR từ các biểu đồ khuếch đại (một biểu đồ về dấu hiệu huỳnh quang so với số lượng chu kỳ; các giá trị ngưỡng khác nhau có thể thích hợp cho các dạng mẫu khác nhau; 51). Các giá trị CT được sử dụng để đánh giá các mẫu cả về virus FMD dương tính lẫn âm tính, phải được xác định bởi các phòng thí nghiệm riêng biệt, sử dụng chất liệu tham khảo thích hợp. Thí dụ, ở Phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright, các mẫu âm tính đối chứng sẽ có giá trị CT từ >50,0. Các mẫu xét nghiệm dương tính và các mẫu đối chứng dương tính phải có giá trị CT <40. Các mẫu mà có giá trị CT rơi vào giới hạn 40-50 được coi là “tại ngưỡng – borderline” và có thể phải xét nghiệm lại, Các mẫu xét nghiệm FMD dương tính mạnh có giá trị CT dưới 20,0 (51).

 Dung dịch dự trữ cho xét nghiệm PCR thời gian thực (stock solutions for real-time PCR assay)

  1. Nước chứa nuclease tự do và các hỗn hợp chính của phản ứng PCR thời gian thực là sẵn có trên thị trường.

  2. Cả những đoạn mồi nêu dưới đây và các bộ đoạn thăm dò đều có thể sử dụng cho PCR thời gian thực của virus FMD:

5’UTR (51) đoạn mồi trở đi (forward primer): CACYT YAAGR TGACA YTGRT ACTGG TAC; đoạn mồi trở lại (reverse primer): CAGAT YCCRA GTGWC ICITG TTA và đoạn thăm dò TaqMan®: CCTCG GGGTA CCTGA AGGGC ATCC.

3D (18) đoạn mồi trở đi (forward primer): ACTGG GTTTT ACAAA CCTGT GA; đoạn mồi trở lại (reverse primer): GCGAG TCCTG CCACG GA và đoạn thăm dò TaqMan®: TCCTT TGCAC GCCGT GGGAC.

 Dịch tễ học phân tử (molecular) epidemiology

Dịch tễ học phân tử của FMD dựa vào so sánh khác biệt di truyền giữa các virus. Cây phân loài (dendrograms) đã được công bố thể hiện liên quan gen di truyền giữa các dòng virus thực địa và vaccin của cả bảy chủng huyết thanh dựa vào kết chuỗi lấy từ gen 1D (mã hóa cho protein VP1 của virus). Quá trình khuếch đại PCR sử dụng enzyme giải mã đảo ngược (Reverse-transcription PCR – RT-PCR) của RNA của virus FMD, tiếp theo là nhận diện kết chuỗi nucleotide, là chọn lựa thích hợp hiện nay cho tạo ra dữ liệu kết chuỗi để thực hiện các so sánh này. Nhiều phòng thí nghiệm đã được phát triển các kỹ thuật để thực hiện những nghiên cứu này, các phòng thí nghiệm tham chiếu hiện nay có dữ liệu của trên 3000 bộ phận kết chuỗi.

Phương pháp được khuyến cáo là để:


  1. Chiết xuất RNA của virus FMD một cách trực tiếp từ huyễn dịch biểu bì hay từ một mẻ tế bào cấy truyền ít lượt.

  2. Thực hiện một RT-PCR cho toàn bộ gen 1D (hoặc chỉ một phần của gen 1D, thì các đầu 3’ của gen là có ích nhất).

  3. Xác định kết chuỗi nucleotide của sản phẩm PCR (hay ít nhất 170 nucleotides [thích hợp là 420 đối với các chủng SAT] ở đầu 3’ của gen này).

Một giao thức, đầy đủ với các kết chuỗi đoạn mồi, sẵn có ở các Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE hay có thể tải về từ các liên kết sau đây:

http://www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphthovirus/fmd.htm

http://bvs.panaftosa.org.br/textoc/SerManDid17.pdf

2. Các xét nghiệm huyết thanh học

Các xét nghiệm huyết thanh học cho FMD được thực hiện cho bốn mục đích: 1) để chứng nhận cho thú vật trước khi nhập khẩu hay xuất khẩu (tức là cho giao thương); 2) để xác nhận các trường hợp nghi ngờ của FMD; 3) để chứng minh bệnh nhiễm; 4) để chứng minh tính hiệu lực của vaccin. Để chứng minh sạch bệnh, các tiếp cận khác nhau cần đến tùy theo có hay không quần thể đã được cấp vaccin hay chưa, và nếu đã sử dụng vaccin, thì có hay không việc sử dụng là một ứng dụng khẩn cấp hay là một phần của một chương trình vaccin đang tiến hành. Các xét nghiệm khác nhau và các giải thích khác nhau về các kết quả xét nghiệm sẽ là thích hợp tùy theo các mục đích đã nêu trên và quá trình đánh giá của phương pháp được chọn phải tính đến mục đích. Thí dụ, các ngưỡng của xét nghiệm có thể thiết lập ở các ngưỡng khác nhau cho giám sát dựa trên đàn, hơn là theo chứng nhận về sạch khỏi bệnh nhiễm từ các thú vật với mục đích giao thương quốc tế.

Các xét nghiệm huyết thanh học đối với FMD có hai dạng; xét nghiệm mà phát hiện các kháng thể đối với protein cấu trúc của virus (structural protein – SP) và xét nghiệm phát hiện các kháng thể không cấu trúc của virus (nonstructural proteins – NSPs).

Các xét nghiệm SP đặc hiệu theo chủng huyết thanh và phát hiện các kháng thể được khiến tạo bởi vaccin và bởi bệnh nhiễm; các thí dụ là xét nghiệm trung hòa virus (virus neutralisation – VN) (32), ELISA cạnh tranh thể rắn (solid-phase competition ELISA) (SPCE; 41, 46) và ELISA kết khối thể lỏng (liquid-phase blocking ELISA) (LPBE; 35, 36). Những xét nghiệm này đều đặc hiệu với chủng huyết thanh và có độ nhạy cao, với điều kiện là virus hay kháng nguyên sử dụng trong xét nghiệm là thích hợp với dòng lưu hành trên thực địa. Đó là các xét nghiệm cần thiết cho giao thương và thích hợp cho xác nhận bệnh nhiễm trước đó hay hiện tại trên thú vật chưa được cấp vaccin cũng như để thể hiện miễn dịch tạo được bằng sử dụng vaccin trên thực địa. Xét nghiệm VN cần đến trang thiết bị nuôi cấy tế bào, sử dụng virus sống và cần 2-3 ngày để cho ra kết quả. Các xét nghiệm ELISA dựa vào kết khối (blocking) hay cạnh tranh (competition) sử dụng các kháng thể đa giá hay đơn giá, thì thực hiện nhanh hơn và không phụ thuộc vào các hệ thống nuôi cấy và virus sống. Các phản ứng dương tính sai với hiệu giá thấp có thể được cho là tỷ lệ nhỏ của huyết thanh trong cả hai xét nghiệm ELISA này. Một tiếp cận kết hợp thể hiện bởi ELISA và xác nhận dương tính bởi xét nghiệm VN sẽ làm giảm thiểu sự xuất hiện của các kết quả dương tính sai. Huyết thanh tham chiếu để chuẩn độ các xét nghiệm huyết thanh học về SP của FMD cho một số chủng huyết thanh và các phân chủng (subtypes) hiện sẵn có ở Phòng thí nghiệm Tham chiếu ở Pirbright.

Việc phát hiện kháng thể đối với các NSPs của virus FMD có thể được áp dụng để xác định bệnh nhiễm trước đó hay hiện tại, với bất kỳ chủng nào trong bảy chủng huyết thanh của virus, có hay không con thú đã được cấp vaccin. Do đó các xét nghiệm này có thể áp dụng được để xác nhận các trường hợp nghi ngờ FFMD và để phát hiện tác động của virus hay chứng minh sạch bệnh trên quần thể. Để chứng nhận cho giao thương thú vật, các xét nghiệm này có lợi thế hơn các phương pháp SP do không biết được chủng huyết thanh của virus. Tuy nhiên, ở đây có bằng chứng thực nghiệm rằng một số bò, đã được cấp vaccin và sau đó được thử thách với virus sống và xác nhận bị nhiễm dai dẳng, có thể không phát hiện được trong một số xét nghiệm kháng NSP, do các kết quả âm tính sai (17). Những xét nghiệm này đo lường kháng thể đối với các NSPs, sử dụng các kháng nguyên được tạo ra bằng các kỹ thuật tái tổ hợp trong các hệ thống ngoại môi trường khác nhau. Các kháng thể kháng với các polyproteins 3AB hay 3ABC hiện nay được coi là tin cậy nhất để chỉ thị của bệnh nhiễm (42). Ở các con thú huyết thanh dương tính đối với 3AB hay 3ABC, kháng thể đối với một hay nhiều NSPs khác có thể giúp cho diễn giải kết luận của xét nghiệm (14, 42). Tuy nhiên, vaccin thiếu tính tinh khiết có thể ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và sự hiện diện của các NSPs trong một số chế phẩm vaccin có thể dẫn đến phân loại sai cho thú vật mà đã được cấp vaccin nhiều lần. Các phương pháp để đánh giá tính tinh khiết của vaccin được nêu trong Đoạn D của chương này.

Huyết thanh tiêu chuẩn quốc tế cho xét nghiệm NSP ở bò đã được phát triển và sẵn có ở Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE, Panaftosa, PAHO/WHO. Trong tương lai, huyết thanh tiêu chuẩn cũng sẽ sẵn có cho cừu và heo. Các bộ huyết thanh (serum panel) đã được thiết lập để so sánh độ nhạy của các xét nghiệm NSP ở các Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE.



a) Xét nghiệm trung hòa virus (virus neutralisation test) (một xét nghiệm cần thiết cho giao thương quốc tế)

Vi xét nghiệm VN định lượng (quantitative VN microtest) cho kháng thể FMD được thực hiện với các tế bào IB-RS-2, BHK-21, tế bào thận cừu non hay heo, trong các phiến vi hiệu giá nuôi cấy tế bào có đáy phẳng (flat-bottomed tissue-culture grade microtitre plates).

Đàn virus cấy trên các tế bào nuôi cấy đơn lớp và được bảo quản ở -20oC sau khi thêm vào glycerol 50%. (Cho thấy virus bền bỉ trong điều kiện này đến ít nhất là 1 năm). Huyết thanh được làm bất hoạt ở 56oC trong 30 phút trước khi xét nghiệm. Huyết thanh đối chứng chuẩn là huyết thanh của thú khỏi bệnh 21 ngày hay huyết thanh sau khi được cấp vaccin. Một môi trường tiện dụng là môi trường tổng hợp Eagle/LYH (dung dịch muối cân bằng của Hank với lactalbumin của men đã thủy phân) với đệm hepes và các chất kháng sinh.

Xét nghiệm này là một xét nghiệm thể tích tương đương với số lượng 50 µl.



o Phương pháp xét nghiệm

  1. Bắt đầu từ độ pha loãng ¼, huyết thanh được pha loãng gấp hai lần, các chuỗi pha loãng trên phiến, sử dụng ít nhất hai hàng giếng cho mỗi huyết thanh, thích hợp là bốn hàng, và có thể tích là 50 µl.

  2. Cho virus đã được chuẩn độ vào; mỗi 50 µl đơn vị thể tích của huyễn dịch chứa virus phải chứa khoảng 100 TCID50 (50% liều gây nhiễm mô nuôi cấy – tissue culture infective dose) trong giới hạn chấp nhận được (như 32 đến 320 TCID50).

  3. Đối chứng bao gồm một kháng huyết thanh chuẩn đã biết hiệu giá, một huyết thanh âm tính, một lớp tế bào đối chứng, một môi trường đối chứng, và một hiệu giá virus được sử dụng để tính toán hiệu giá virus hiện tại được sử dụng trong xét nghiệm.

  4. Ủ ở 37oC trong 1 giờ, phiến được đậy nắp.

  5. Một huyễn dịch tế bào ở 106 tế bào/ml được tạo thành trong môi trường chứa huyết thanh bò 10% (kháng thể âm tính đặc trưng) cho tế bào phát triển. Một thể tích 50 µl huyễn dịch tế bào được cho vào từng giếng.

  6. Các phiến được đậy kín bằng băng keo và được ủ ở 37oC trong 2-3 ngày. Cách khác, các phiến có thể được đậy bằng nắp vừa vặn và được ủ trong khí quyển có chứa 3-5% carbone dioxide ở 37oC trong 2-3 ngày.

  7. Việc đọc bằng kính hiển vi có thể thực hiện sau 48 giờ. Các phiến này cuối cùng được cố định và nhuộm màu vào ngày thứ ba. Quá trình cố định có hiệu quả với 10% formol/saline (nước muối) trong 30 phút. Để nhuộm màu, các phiến được ngâm trong xanh methylene 0,05% trong 10% formalin trong 30 phút. Cách khác cho cố định/nhuộm màu là dùng dung dịch xanh đen naphthalene (0,4% [w/w] naphthalene xanh đen, 8% [w/v] acid citric trong saline [nước muối]). Các phiến này được xả bằng nước sạch.

  8. Các giếng dương tính (ở đây virus đã bị trung hòa và tế bào vẫn còn nguyên vẹn) thấy bên trong là tấm tế bào màu xanh dương; các giếng âm tính (virus không bị trung hòa) thì trống rỗng. Các hiệu giá được thể hiện là độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh hiện diện trong hỗn hợp huyết thanh/virus, mà 50% các giếng được bảo vệ (38). Xét nghiệm được coi là có giá trị khi lượng virus sử dụng cho mỗi giếng trong giới hạn log10 1,5-2,5 TCID50, và huyết thanh chuẩn dương tính là ở độ pha loãng gấp hai theo hiệu giá của huyết thanh.

  9. Việc giải thích các kết quả xét nghiệm có thể khác nhau giữa các phòng thí nghiệm về ngưỡng dương tính/âm tính. Các phòng thí nghiệm phải thiết lập tiêu chí bằng tham khảo đến các tác nhân thử mà có thể có được từ Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE ở Pirbright. Thông thường, một hiệu giá từ 1/45 hay hơn của độ pha loãng huyết thanh cuối cùng trong hỗn hợp huyết thanh/virus được coi là dương tính. Một hiệu giá dưới 1/16 được coi là âm tính. Để chứng nhận cho cá thể thú vật với mục đích giao thương quốc tế, các hiệu giá từ 1/16 đến 1/32 được coi là nghi ngờ, và phải lấy thêm mẫu huyết thanh để xét nghiệm; các kết quả được coi là dương tính nếu mẫu lần thứ nhì có hiệu giá là 1/16 hay cao hơn. Với các mục đích về giám sát trên cơ sở đàn, như một phần của đánh giá thống kê về huyết thanh học, một ngưỡng từ 1/45 có thể thích hợp. Các hiệu giá ngưỡng cho đánh giá miễn dịch bảo hộ được tạo nên bởi vaccin sẽ được thiết lập từ kinh nghiệm về các kết quả tiềm tàng với vaccin liên quan và loài mục tiêu.

b) Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme-cạnh tranh-thể rắn (solid-phase competition enzyme-linked immunosorbent assay) (một xét nghiệm cần thiết cho giao thương quốc tế)

Kháng huyết thanh của thỏ đối với kháng nguyên 146S của một trong bảy chủng huyết thanh của virus FMD được sử dụng làm bẫy kháng thể ở một nồng độ tối ưu đã định trong đệm carbonate/bicarbonate, pH 9.6.

Các kháng nguyên được chuẩn bọ bằng làm bất hoạt virus đã được cấy trên tế bào nuôi cấy, bằng ethyleneimine, áp dụng các phương pháp giống như với sản xuất vaccin. Độ pha loãng cuối cùng tốt nhất là, sau khi thêm một thể tích tương đương dịch pha loãng, cho ra mức độ hấp phụ có giá trị ở vùng trên của đường biểu diễn hiện giá (mật độ quang học khoảng 1,5). PBS chứa 0,05% Tween 20, 10% huyết thanh bò bình thường và 5% huyết thanh thỏ bình thường, và sử dụng đỏ phenol làm chỉ thị cho độ pha loãng (kết hợp đệm – blocking buffer).

Kháng huyết thanh của chuột lang (guinea-pig), được chuẩn bị bằng cấy vào chuột lang kháng nguyên 146S của một trong bảy chủng huyết thanh virus FMD và đã được kết hợp trước với huyết thanh bò bình thường, được sử dụng để phát hiện kháng thể. Các nồng độ tối ưu đã định trước được chuẩn bị trong kết hợp đệm PBS có chứa 0,055 Tween 20, và 5% sữa khô đã tách béo (PBSTM).

Globulin miễn dịch của thỏ (hay cừu) kháng globulin miễn dịch của chuột lang đã được kết hợp với enzyme peroxidase của cây cải ngựa (horseradish peroxidase) và đã được kết hợp trước với NBS, được sử dụng làm tiếp hợp ở một nồng độ tối ưu đã định trong kết hợp đệm PBSTM.

Huyết thanh xét nghiệm được pha trong kết hợp đệm PBST.



ELISA cạnh tranh thể rắn (solid-phase competitive ELISA) thì đặc hiệu hơn, nhưng độ nhạy cũng giống như ELISA kết khối thể lỏng (liquid-phase blocking ELISA) (41, 46). Các phương pháp đã được đề cập cho phát triển huyết thanh phụ và sử dụng huyết thanh phụ (33) và cho thực hiện đồ thị (34).

o Phương pháp xét nghiệm

  1. Các phiến ELISA được tráng 50 µl mỗi giếng bằng huyết thanh thỏ kháng kháng nguyên virus FMD đã được pha loãng trong đệm carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.6, và để qua đêm trong buồng ẩm ở 4oC.

  2. Các phiến ELISA này được rửa ba lần bằng PBS.

  3. Sau đó 50 µl kháng nguyên của virus FMD đã được pha loãng trong kết hợp đệm, được thêm vào từng giếng của các phiến ELISA này. (Kết hợp đệm: : 0.05% [w/v] Tween 20, 10% [v/v] huyết thanh bò bình thường, 5% [v/v] huyết thanh thỏ bình thường.)

Các phiến này được đậy nắp và đặt vào máy lắc vòng tròn ở 37oC trong 1 giờ, lắc liên tục.

  1. Sau khi rửa ba lần với PBS, 40 µl kết hợp đệm được thêm vào từng giếng, sau đó cho 10 µl huyết thanh xét nghiệm (hay huyết thanh đối chứng), cho ra một độ pha loãng huyết thanh ban đầu là 1/5.

  2. Ngay sau đó cho vào 50 µl huyết thanh chuột lang kháng với kháng huyết thanh của virus FMD trong kết hợp đệm, cho ra độ pha loãng huyết thanh cuối cùng là 1/10.

  3. Các phiến này được đậy lại và được ủ trong máy lắc tròn ở 37oC trong 1 giờ.

  4. Sau khi rửa ba lần bằng PBS, cho vào 50 µl của kết hợp Ig kháng với huyết thanh chuột lang (đã được kết hợp trước bằng ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với thể tích tương đương của NBS) được đã pha trong kết hợp đệm. Các phiến này được đậy lại và ủ trong 1 giờ ở 37oC trong máy lắc tròn.

  5. Sau khi rửa ba lần bằng PBS, 50 µl dung dịch chất nền, chứa 0,05% H2O2 cộng với orthophenylene diamine hay một chất màu thích hợp khác, được cho vào từng giếng.

  6. Phản ứng được làm ngưng sau 10 phút bằng thêm 50 µl acid sulphuric 1 M. Các phiến này được đọc ở 492 nm trong một quang phổ kế kết nối với máy tính.

  7. Đối chứng: Trên mỗi phiến, hai giếng được dùng cho kết hợp đối chứng (không có huyết thanh chuột lang), bốn giếng của từng phiến được dùng cho huyết thanh dương tính yếu và mạnh, hai giếng cho huyết thanh âm tính, và bốn giếng cho cạnh tranh 0% (không có huyết thanh xét nghiệm).

  8. Giải thích các kết quả: Tỷ lệ ức chế được tính cho từng giếng, kể cả tính toán bằng thủ công lẫn sử dụng một chương trình vi tính thích hợp (100 – [mật độ quang học của từng giá trị xét nghiệm hay đối chứng/giá trị của mật độ quang học của cạnh tranh 0%] x 100%), thể hiện cạnh tranh giữa huyết thanh xét nghiệm với kháng huyết thanh của chuột lang đối với huyết thanh kháng virus FMD trong kết hợp với kháng nguyên của virus FMD trong phiến ELISA. Các phòng thí nghiệm phải xác định xét nghiệm giá trị ngưỡng cao hơn ngưỡng được cho là dương tính, mà có liên quan đến (i) chủng huyết thanh và dòng đặc trưng của virus được điều tra, (ii) mục đích xét nghiệm, (iii) quần thể thú vật được giám sát, sử dụng các phương pháp được nêu trong Chương 1.1.4. Các nguyên tắc về đánh giá các xét nghiệm chẩn đoán đối với các bệnh truyền nhiễm. Ở Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE ở Pirbright, với chủng huyết thanh O, với tất cả các loài, cho mục đích chứng minh sạch bệnh trong quần thể chưa bị nhiễm, thì ức chế lớn hơn 60% được coi là dương tính (46). Với độ nhạy tối đa, thí dụ khi chứng nhận cá thể thú vật cho giao thương quốc tế, một giới hạn bao gồm có thể thiết lập từ 40 đến 60%.

Каталог: Download -> 2011 -> Tuan38
Download -> Ex: She has said, “ I’m very tired” → She has said that she is very tired. Một số thay đổi khi đổi sang lời nói gián tiếp như sau
Download -> Wedding album prices menu of jessica
Download -> Cách thêm Album hình cho website hình ảnh
Download -> CỘng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam
Tuan38 -> Ở đây có ba giống virus cúm A, b và C; chỉ các virus cúm a mới gây bệnh cho các loài chim. Các chẩn đoán là bằng phân lập hay phát hiện và phân loại cho virus
2011 -> Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (prrs) có đặc điểm là thất bại sinh sản ở heo nái và các vần đề hô hấp của heo con và heo cai sữa
2011 -> BỆnh lê DẠng trùng (babesiosis) Mở đầu
2011 -> Trong nhiều quốc gia, bệnh lao bò là bệnh truyền nhiễm chính trên đàn bò, các thú vật thuần dưỡng khác, và một số quần thể hoang dã. Sự truyền lây sang người gây nên vấn đề sức khỏe cộng đồng

tải về 387.03 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương