Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (prrs) có đặc điểm là thất bại sinh sản ở heo nái và các vần đề hô hấp của heo con và heo cai sữa



tải về 144.92 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu25.09.2016
Kích144.92 Kb.
H
Nguồn: http://www.oie.int/

Người dịch: Đặng Nguyên Bình


ỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO


(PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME – PRRS)

TÓM TẮT

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) có đặc điểm là thất bại sinh sản ở heo nái và các vần đề hô hấp của heo con và heo cai sữa. Bệnh do virus PRRS, một loại virus hiện nay được xếp vào thành viên của bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Artevirus. Tế bào mục tiêu hàng đầu của virus này là đại thực bào trong phế nang của heo. Hiện có hai chủng kháng nguyên chính của virus, là chủng Châu Âu và chủng Châu Mỹ. Virus chủ yếu truyền lây từ heo bị nhiễm bệnh, nhưng virus cũng truyền lây qua phân, nước tiểu, tinh dịch và dụng cụ.

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp xảy ra chủ yếu tại các khu vực có chăn nuôi heo trên thể giới. Rối loạn sinh sản có đặc điểm là vô sinh, chết thai muộn, xảy thai, đẻ non và sinh ra heo con yếu ớt, heo con thường chết sớm sau khi sinh do bệnh đường hô hấp và các bệnh phụ nhiễm. Heo lớn hơn có thể thể hiện các triệu chứng nhẹ của bệnh đường hô hấp, thường phức tạp thêm do phụ nhiễm. Không thấy có loài thú vật nào khác thể hiện bị nhiễm tự nhiên với virus bệnh PRRS.

Nhận diện tác nhân: Các chẩn đoán virus học đối với bệnh nhiễm virus PRRS khá khó khăn; virus này có thể phân lập được từ các mô như huyết thanh, các dịch tiết từ heo còi cọc (ascitic fliuds), phổi, hạch hạnh nhân (tonsil), các hạch bạch huyết và lách của heo bị bệnh. Do các đại thực bào phế nang của heo là hệ thống nuôi cấy mẫn cảm nhất cho virus của cả hai chủng kháng nguyên, những tế bào này được khuyên dùng cho phân lập virus. Các tế bào MARC-145 (dòng vô tính MA-104) cũng thích hợp. Ở đây có khác biệt giữa các lô đại thực bào về khả năng mẫn cảm với virus PRRS. Do đó, cần phải tìm ra các lô đại thực bào có khả năng mẫn cảm cao, và bảo quản lô này trong nitrogen lỏng cho đến khi cần dùng. Virus được nhận diện và phân loại bằng nhuộm màu miễn dịch với kháng huyết thanh đặc hiệu. Các kỹ thuật bổ trợ như miễn dịch mô bào học và lai ghép tại phòng thí nghiệm (in situ) trong các mô đã được cố định và phản ứng chuỗi đa phân tử enzyme giải mã đảo ngược (reverse-transcription polymerase chain reaction) đã được phát triển để xác nhận bệnh nhiễm PRRS tại phòng thí nghiệm.

Các xét nghiệm huyết thanh học: Có nhiều xét nghiệm hiện nay để phát hiện các kháng thể trong huyết thanh đối với virus PRRS. Xét nghiệm miễn dịch ô xy hóa đơn lớp (immunoperoxidase monolayer assay) sử dụng các đại thực bào phế nang và xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp sử dụng các tế bào MARC-145 thường được gây nhiễm bằng cả hai chủng kháng nguyên Châu Âu và Châu Mỹ. Tuy nhiên, cả hai xét nghiệm này đều được thiết kế theo cả dạng tế bào lẫn theo virus PRRS. Xét nghiệm thương mại ELISA hiện nay thường được sử dụng. Một bộ xét nghiệm thương mại đặc hiệu cho cả chủng virus Châu Âu lẫn Châu Mỹ. Một bộ xét nghiệm ELISA gián tiếp, là ELISA ghép khối (blocking ELISA) và ELISA kép (double ELISA) có thể phân biệt giữa các phản ứng huyết thanh của chủng Châu Âu với chủng Châu Mỹ.

Các yêu cầu cho vaccin và các chẩn đoán sinh học: Các vaccin có thể có giá trị giúp ngăn ngừa các dạng triệu chứng rối loạn sinh sản và hô hấp của PRRS. Các vaccin có virus sống đã làm biến đổi thì không thích hợp sử dụng cho nái mang thai, nái tơ và heo đực. Tiêm phòng vaccin này có thể dẫn đến thải tiết ra virus vaccin trong tinh dịch. Các virus vaccin đã làm biến đổi có thể tồn tại lâu dài trong heo đã được tiêm phòng, và đã có báo cáo về lây lan virus vaccin sang heo không tiêm phòng và sau đó gây ra bệnh do virus vaccin.

A. MỞ ĐẦU

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) có đặc điểm là rối loạn sinh sản trên heo nái và bệnh hô hấp trên heo (2). Bệnh này đầu tiên phát hiện ra vào năm 1987 ở Mỹ, và trong vòng vài năm phát triển thành dịch. PRRS là do virus, virus này lần đầu tiên phát hiện thấy ở Hà Lan (33) và được phân loại là thành viên của bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus (4). Virus PRRS là loại virus RNA kết sợi đơn chiều dương, đặc tính sinh học của virus này đã được phân loại. Ngay sau khi phát hiện, virus đã được phân loại thành các dòng Bắc Mỹ (North American – NA) và dòng Châu Âu (EU), thể hiện hai chủng di truyền có tính kháng nguyên khác nhau (20, 25, 32). Các điều tra đã chứng minh thêm sự khác biệt giữa virus của hai lục địa. Những khác biệt này hiện nay đã trở nên mờ nhạt do virus PRRS giống NA đã du nhập vào Châu Âu (qua sử dụng vaccin đã biến đổi chế tạo từ một dòng NA) và virus giống EU đã tìm thấy ở Bắc Mỹ. Hầu hết các dòng phân lập từ Nam Mỹ và Châu Á đều giống với NA và hình như những virus này được du nhập qua di chuyển của heo và/hoặc tinh dịch.

Ở đây có sự gia tăng biến thể đối với các dòng của hai kiểu gen này, mà góp phần vào tỷ lệ lỗi cao trong quá trình sao chép của virus PRRS (5) và quá trình tái tổ hợp giữa các dòng (28). Ở đây cũng có các mô tả mới về phương pháp nhuộm màu với chỉ số đa hình thái cao, tạo thêm hiểu biết về sự nổi lên các mầm bệnh mới của heo (26). Tác động của tính đa dạng này trong các chẩn đoán và vaccin còn chưa biết nhiều, nhưng đã đặt ra vấn đề và phải được quan tâm.

Hội chứng sinh sản được ghi nhận là xảy thai muộn và đẻ non hay đẻ muộn mà có thai chết và thai khô, heo con sinh ra chết ngay và heo con sinh ra yếu ớt. Sự gia tăng số lượng trường hợp trong giai đoạn cấp tính của ổ dịch bệnh động vật này thường được báo cáo. Có các báo cáo một cách bất thường về rối loạn sinh sản sớm và rối loạn giữa thai kỳ. Ở heo nọc và heo nái hậu bị, có thể quan sát thấy sốt và biếng ăn tạm thời. Hội chứng hô hấp được ghi nhận là khó thở (thoi thóp), sốt, biếng ăn và lờ đờ. Các heo nhỏ hơn thường bị nhiễm nhiều hơn heo lớn, heo nọc và heo nái (hậu bị) thường bị nhiễm không triệu chứng (subclinical infection). Sự gia tăng phụ nhiễm thường xảy ra và tỷ lệ tử vong có thể cao. Ở heo nọc bị nhiễm PRRS tự nhiên và heo nọc đã được tiêm phòng vaccin virus nhược độc, virus PRRS có thể được thải tiết vào tinh dịch, đã có các báo cáo về các biến đổi hình thái và chức năng của tinh trùng (7). Virus truyền lây chủ yếu từ heo đã bị nhiễm và cũng truyền lây qua phân, nước tiểu và tinh dịch. Virus cũng có thể truyền lây một cách gián tiếp, có thể qua các đường khí dung và qua các trung gian cơ học. Các bệnh tích đại thể và vi thể do bệnh nhiễm virus PRRS đã được mô tả (13). Thông thường, các bệnh tích này nặng nề hơn ở thú non. Các khác biệt về độc lực giữa các dòng phân lập của virus PRRS trong một chủng di truyền (genotypes) và giữa các chủng di truyền được cho là dựa vào các quan sát thực tế và một số nghiên cứu thực nghiệm (13). Tuy nhiên ở đây còn phải thực hiện nhiều nghiên cứu sâu rộng về virus PRRS, ở đây còn nhiều lỗ hổng trong hiểu biết về mối liên quan giữa virus PRRS với các bệnh khác, cũng như hiểu biết về đáp ứng miễn dịch đối với virus PRRS.



B. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN

1. Nhận diện tác nhân gây bệnh

Việc nhận diện virus PRRS có thể thực hiện bằng phân lập virus, phát hiện các acid nucleic và phát hiện các proteins của virus. Việc phân lập virus có thể khó khăn do tất cả các dòng phân lập (đặc biệt là các virus dòng Châu Âu) có thể không dễ dàng gây nhiễm vào tế bào nuôi cấy lấy từ lớp thế bào MA-104 của thận khỉ (16). Thú vị là hệ thống tế bào nuôi cấy liên tục này chỉ có một báo cáo về dung nạp gây nhiễm bởi virus PRRS. Các đại thực bào phế nang của heo (porcine alveolar macrophage – PAM) sẽ giúp cho hầu hết các dòng phân lập của virus PRRS (nhưng không phải là tất cả) sinh sôi được. Tuy nhiên, việc thu thập PAM là công việc không dễ dàng do chỉ có heo với tình trạng sức khỏe khỏe mạnh và dưới 8 tuần tuổi mới sử dụng được làm nguồn cung cấp PAM (33). Các lô PAM khác nhau thường không có khả năng mẫn cảm giống nhau đối với virus PRRS; do đó cần phải xét nghiệm từng lô trước khi sử dụng. PAM có thể được dự trữ trong nitrogen lỏng cho đến khi đem sử dụng, như mô tả phần sau. Việc phân lập virus PRRS sử dụng PAM là một kỹ thuật mà có thể thực hiện được trong hầu hết các phòng thí nghiệm chẩn đoán. Kỹ thuật này có độ nhạy để phân lập được tất cả các dòng virus PRRS và sẽ được giải thích chi tiết. Việc phát hiện acid nucleic của virus PRRS có thể thực hiện được bằng phản ứng chuỗi phân tử sử dụng enzyme giải mã nghịch đảo (reverse-transcription polymerase chain reaction – RT-PCR), RT-PCR chồng lớp (nested set RT-PCR) và RT-PCR thời gian thực (real-time RT-PCR) (17, 18, 22, 30, 31). Những xét nghiệm này thường được áp dụng để phát hiện acid nucleic trong các mô và huyết thanh. Các xét nghiệm này cũng có ích khi việc phân lập virus chưa chắc chắn, như khi xét nghiệm tinh dịch (7) và xét nghiệm cho các mô mà đã bị phân hủy phần nào bởi tự dung giải (autolysis) hay bởi nhiệt độ trong quá trình vận chuyển các mẫu đi phân lập virus. Một xét nghiệm PCR phức hợp (multiplex PCR) đã được thiết kế để phân biệt các dòng phân lập Bắc Mỹ với Châu Âu (11). Các phân tích độ dài đoạn đa hình thái của các sản phẩm PCR-khuyếch đại đã được phát triển để phân biệt các dòng virus thực địa với virus vaccin (34) và mới đây, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử về các dòng virus PRRS đã được thực hiện, sử dụng các phân tích phân loài học trong các cấu trúc kết nối gen di truyền đặc hiệu. Tất cả các xét nghiệm về acis nucleic này thường nhanh chóng hơn so với phân lập virus và không cần đến cơ sở tế bào nuôi cấy. Mặc dù hiếm khi áp dụng cho các mục đích chẩn đoán, việc lai ghép trong phòng thí nghiệm (in situ) là khả năng cho phát hiện và phân biệt giữa các kiểu di truyền của virus PRRS Bắc Mỹ với Châu Âu trong các mô đã được cố định bằng formalin (20). Hóa miễn dịch mô bào (immunohistochemistry) có thể áp dụng được để phát hiện các proteins của virus (12, 19) và khi thực hiện trên các mô đã được cố định bằng formalin cho phép hiển thị được kháng nguyên cùng với các bệnh tích mô bào học.



a) Thu thập các đại thực bào phế nang từ phổi

Thích hợp là phổi lấy từ heo SPF hay từ đàn heo mà chứng minh được là sạch đối với bệnh nhiễm virus PRRS. Các kết quả tốt nhất thu được từ các heo dưới 8 tuần tuổi. Các đại thực bào phải được thu thập từ phổi trong ngày mà heo được giết mổ. Phổi được rửa ba hay bốn lần với tổng thể tích nước muối đệm phosphate (phosphate buffered saline – PBS). Dịch rửa thu gom được sau đó được ly tâm trong 10 phút ở 1000 g. Các đại thực bào trầm lắng thu được sau đó được tái hòa tan trong PBS và ly tâm (thao tác rửa) hai lần nữa. Trầm lắng cuối cùng được hòa tan trong 50 ml PBS, và số lượng các đại thực bào được đếm để tính toán hàm lượng. Các đại thực bào này sau đó có thể được sử dụng tươi, hay có thể được bảo quản trong nitrogen lỏng theo các phương pháp chuẩn ở hàm lượng cuối cùng khoảng 4 x 107 đại thực bào/1,5 ml. Các lô đại thực bào không nên đem trộn chung.



b) Xét nghiệm theo lô các đại thực bào phế nang

Trước khi một lô đại thực bào có thể sử dụng được, thì phải được đánh giá. Điều này sẽ thực hiện bằng cách chuẩn độ một lượng virus PRRS đã biết trước chuẩn độ vào các đại thực bào mới, và bằng thực hiện một xét nghiệm đơn lớp miễn dịch ô xy hóa (immunoperoxidase monolayer assay – IPMA) với huyết thanh biết trước là dương tính và âm tính trên các phiến cấy với các đại thực bào mới. Các tế bào này chỉ thích hợp cho sử dụng nếu virus PRRS chuẩn phát triển đến hiệu giá đã được chỉ định, (TCID50 hay 50% liều lượng gây nhiễm mô cấy – Tissue Culture Infective Dose). Ở đây khuyến cáo là các đại thực bào phế nang và huyết thanh phôi bò (Fetal Bovine Serum – FBS) dùng cho môi trường nuôi cấy phải sạch đối với pestivirus.



c) Phân lập virus trên các đại thực bào phế nang

Các đại thực bào phế nang được cấy vào các giếng đáy bằng của các phiến vi hiệu giá tăng dần dùng cấy mô. Sau khi cấy, các đại thực bào được gây nhiễm bằng mẫu xét nghiệm. Các mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh hay dịch cơ thể, hay nhuyễn dịch của các mô, như hạch hạnh nhân, phổi, các hạch bạch huyết và lách. Thông thường, virus PRRS gây ra tác động bệnh tích tế bào (cytopathic effect – CPE) trong các đại thực bào, sau 1-2 ngày cấy, nhưng đôi khi virus cho thấy có ít CPE hay chỉ gây CPE sau khi cấy truyền lặp lại. Sau thời gian 1-2 ngày hoặc chỉ khi phát hiện thấy CPE, thì sự hiện diện của virus PRRS cần được xác nhận bằng nhuộm màu miễn dịch (immunostaining) với một kháng huyết thanh đặc hiệu hay một kháng thể đơn giá (monoclonal antibody – MAb).

i) Cấy các đại thực bào vào các phiến vi hiệu giá (microtitre plates)

Làm tan giá một chai chứa 6 x 107 đại thực bào/1,5 ml. Rửa các tế bào một lần với 50 ml PBS và ly tâm dung dịch chứa tế bào này trong 10 phút ở 300 g (nhiệt độ phòng). Thu thập các tế bào này trong 40 ml môi trường 1640 RPMI (Rose-Peake Memorial Institute) được bổ sung 5% FBS và 10% hỗn hợp kháng sinh (môi trường phát triển). Chia 100 µl dịch chứa tế bào vào từng giếng của phiến vi hiệu giá (với một chai chứa tế bào có thể cấy vào bốn phiến ở hàm lượng 105 tế bào trong mỗi giếng của các phiến).

ii) Sửa soạn mẫu (huyết thanh, dịch cơ thể, nhuyển dịch mô 10%) pha loãng trong một phiến đệm (dummy plate)

Chia 90 µl môi trường nuôi cấy vào từng giếng của phiến vi hiệu giá. Thêm 10 µl vào các giếng của các hàng A và E ( độ pha loãng giống nhau 1/10). Lắc các phiến và chuyển 10 µl từ các hàng A và E sang các hàng B và F (độ pha loãng 1/100). Lắc các phiến và chuyển 10 µl từ các hàng B và F sang các hàng C và G (độ pha loãng 1/1000). Lắc các phiến và chuyển 10 µl từ các hàng C và G sang các hàng D và H (độ pha loãng 1/10.000). Lắc các phiến.

iii) Ủ cấy (incubation) các mẫu

Chuyển 50 µl của các độ pha loãng từ phiến pha loãng này đến các giếng tương ứng của phiến có các đại thực bào (cấy truyền lần đầu). Ủ cấy trong 2-5 ngày và quan sát hàng ngày về CPE. Ở ngày thứ 2, cấy các đại thực bào trong một phiến vi hiệu giá mới (xem phần trên). Truyền 25 µl phù nổi từ phiến cấy truyền lần đầu vào các giếng tương ứng của phiến nuôi cấy mới (cấy truyền lần hai). Ủ cấy trong 2-5 ngày và hàng ngày quan sát CPE.

iv) Đọc và giải thích các kết quả

Khi các đại thực bào chỉ thể hiện CPE trên cấy truyền lần đầu thì được coi là dương tính sai do độc tính của mẫu. Khi các đại thực bào của cả hai lần cấy truyền đều thể hiện CPE hay chỉ thể hiện CPE trên lần cấy truyền thứ nhì thì được coi là nghi ngờ dương tính. Khi tất cả các đại thực bào đơn lớp mà không thể hiện CPE, cần phải được xác định là âm tính với virus PRRS bằng nhuộm miễn dịch với một kháng huyết thanh dương tính với virus PRRS hay bằng MAb. Các mẫu có CPE dương tính cần phải được xác định là dương tính với virus PRRS bằng nuôi cấy các phù nổi có CPE dương tính, hay bằng dung dịch mẫu nguyên gốc, trong cả 24 lẫn 48 giờ trong các đại thực bào, sau đó bằng nhuộm miễn dịch với một kháng huyết thanh dương tính với virus PRRS hay MAb.

v) Nhuộm màu miễn dịch (immunostaining) bằng kháng huyết thanh dương tính đối với virus PRRS hay bằng kháng thể đơn giá (MAb)

Gây nhiễm các đại thực bào bằng 50 µl phù nổi hay mẫu mô như được mô tả trong Đoạn B.2.a, và nuôi các tế bào đã gây nhiễm trong 24 và 48 giờ. Sửa soạn một độ pha loãng thích hợp của một huyết thanh dương tính với virus PRRS trong dung dịch đệm pha loãng, và nhuộm màu các đại thực bào như mô tả trong Đoạn B.2.a hay B.2.b.



2. Các xét nghiệm huyết thanh học

Có nhiều xét nghiệm khác nhau đã được mô tả để phát hiện các kháng thể trong huyết thanh đối với virus PRRS. Thông thường, các chẩn đoán huyết thanh học dễ dàng thực hiện, với tính đặc hiệu và độ nhạy tốt, nhất là dựa trên cở sở đàn. Huyết thanh của các cá thể heo đôi khi gây nên khó khăn vì có các phản ứng không đặc hiệu, nhưng vấn đề này có thể hóa giải được bằng lấy mẫu lại ở heo lúc 2-3 tuần. Huyết thanh học thường được thực hiện với một xét nghiệm kết hợp, như IPMA, xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang, hay xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (ELISA) – mà gồm có nhiều biến thể đã được mô tả (1, 6, 8, 14, 23, 25, 33, 35). Những xét nghiệm này thường được thực hiện bằng kháng nguyên virus của một chủng kháng nguyên, tức là những kháng thể kháng trực tiếp với chủng kháng nguyên dị hợp khác có thể phát hiện thấy với độ nhạy thấp hơn. Một xét nghiệm ELISA kết khối (blocking ELISA) đã được sử dụng một cách rộng rãi ở Đan Mạch và đã được mô tả là một bộ ELISA kép (double ELISA set-up) sử dụng cả virus của Châu Âu lẫn Bắc Mỹ làm kháng nguyên và do đó có thể phân biệt giữa phản ứng huyết thanh học đối với các chủng Châu Âu và Bắc Mỹ (25). Vaccin PRRS sống nhược độc đầu tiên dựa vào chủng virus Bắc Mỹ đã nhận thấy có lây truyền virus của vaccin đến các động vật không tiêm phòng vaccin (3, 27), và sau đó virus này phát triển trong các đàn thành hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp do virus vaccin, điều này đã được báo cáo ở Đan Mạch (3, 21). Phản ứng như đối với virus PRRS của vaccin chủng Bắc Mỹ có thể tiên đoán được ở các quốc gia khác đang sử dụng hoặc đã sử dụng vaccin này; do đó tại các quốc gia Châu Âu có thể quan sát thấy các phản ứng và phân lập ra cả hai chủng kháng nguyên (3, 21). Việc nhận diện ra các dòng của virus PRRS chủng Châu Âu tại Mỹ và Canada cũng đã được báo cáo (10), nhưng tỷ lệ lưu hành bệnh nhiễm bởi những dòng này chưa được chứng minh rõ.

Các kháng thể đối với virus này có thể phát hiện được bằng xét nghiệm ngưng kết kháng thể sớm từ 7-14 ngày sau khi nhiễm virus, và hàm lượng kháng thể đạt đến hiệu giá tối đa từ 30-50 ngày. Một số heo có thể trở nên huyết thanh âm tính trong vòng 3-6 tháng, nhưng những heo khác còn giữ được huyết thanh dương tính lâu dài hơn. Các kháng thể trung hòa phát triển một cách chậm chạp và không đạt đến hiệu giá cao. Các kháng thể này có thể phát hiện được từ 3 đến 4 tuần sau khi bị nhiễm và có thể tồn tại đến 1 năm hay lâu hơn. Việc sử dụng bổ thể để thực hiện xét nghiệm trung hòa virus huyết thanh thì có độ nhạy hơn và đã được mô tả (15). Việc nghiên cứu sâu về độ dài thời gian của các hiệu giá kháng thể sau bệnh nhiễm thì chưa được thực hiện, và các kết quả có thể phụ thuộc vào dạng xét nghiệm áp dụng. Các kháng thể mẹ truyền có thời gian bán tồn tại (half-life) từ 12-14 ngày, và hiệu giá kháng thể mẹ truyền có thể, thường phát hiện tồn tại đến 4-8 tuần sau khi sinh, tùy theo hiệu giá kháng thể của heo nái lúc sinh đẻ và dạng xét nghiệm áp dụng. Trong một môi trường đã bị nhiễm, heo con sinh ra từ các heo mẹ có huyết thanh dương tính có thể chuyển hóa huyết thanh một cách chủ động từ lứa tuổi 3-6 tuần.

Chương này mô tả chi tiết IPMA vì xét nghiệm này có thể thực hiện một cách dễ dàng trong các phòng thí nghiệm khi các phương pháp phân lập virus sử dụng đại thực bào đã được thực hiện, và có thể áp dụng được cho cả hai chủng kháng nguyên của virus. Xét nghiệm này cũng có thể thích hợp với lớp tế bào MARC-145 cho cả các chủng Châu Âu và Bắc Mỹ (25). Một xét nghiệm miễn dịch huỳnh quan gián tiếp (indirect immunofluorescent assay – IFA) sử dụng các tế bào MARC-145 cũng có thể được áp dụng cho huyết thanh học của virus PRRS và được nêu trong chương này. Các xét nghiệm ELISA thương mại với độ nhạy và tính đặc hiệu tốt cũng sẵn có và đã được so sánh (9).



a) Phát hiện các kháng thể với xét nghiệm đơn lớp miễn dịch ô xy hóa (immunoperoxidase monolayer assay)

Các đại thực bào phế nang được cấy giống trong các giếng của các phiến vi hiệu giá. Sau khi bám dính, các đại thực bào được gây nhiễm bằng virus PRRS. Mục tiêu là gây nhiễm khoảng 30-50% các đại thực bào trong một giếng sao cho có thể phân biệt với huyết thanh không đặc hiệu. Sau một thời gian ủ cấy, các đại thực bào này được cố định và sử dụng làm tế bào nền cho huyết thanh học. Một phương pháp khác là sử dụng các tế bào MARC-145 thay cho các đại thực bào. Trên từng phiến, 11 huyết thanh có thể được xét nghiệm thành hai bản. Huyết thanh xét nghiệm được pha loãng và được cấy trên tế bào nền. Nếu các kháng thể hiện diện trong huyết thanh đem xét nghiệm, chúng sẽ kết hợp với kháng nguyên trong bào tương của các đại thực bào. Trong bước ủ cấy tiếp theo, các kháng thể đã kết hợp sẽ được phát hiện bởi một kết hợp đặc hiệu kháng loài đối với enzyme peroxidase của cây cải ngựa (anti-species horseradish-peroxidase – HRPO). Cuối cùng, tế bào nền này được ủ cấy với một dung dịch nhiễm sắc chất/chất nền1 (chromogen/substrate solution). Đọc kết quả xét nghiệm với một kính hiển vi phản quang (inverted microscope).



o Cấy giống các đại thực bào trong các phiến vi hiệu giá

  1. Giải đông một chai chứa 6 x 107 đại thực bào/1,5 ml.

  2. Rửa các tế bào một lần với 50 ml PBS và ly tâm dịch chứa tế bào này trong 10 phút ở 300 g (nhiệt độ phòng).

  3. Thu gom các tế bào này bằng 40 ml môi trường RPMI 1640 được bổ sung 5% FBS, 100 IU (đơn vi quốc tế) penicillin và 100 µg streptomycin (môi trường nuôi cấy).

  4. Chia 100 µl dịch chứa tế bào này vào từng giếng của một phiến vi hiệu giá (mỗi một chai tế bào có thể cấy giống cho bốn phiến ở hàm lượng 105 tế bào trong từng giếng của các phiến).

  5. Ủ cấy các phiến torng 18-24 giờ ở 37oC trong buồng có nồng độ CO2 là 5%, với điều kiện ẩm.

Cách khác, sử dụng đệm HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine, N-2-ethanesulphonic acid) trong môi trường.

1 Sửa soạn dung dịch chất nhiễm sắc

Chuẩn bị dung dịch chất nhiễm sắc (3-amino-9-ethyl-carbazole [AEC]): a) 4 mg AEC; b) 1 ml N,N-dimethyl-formamide.

Hòa tan a) trong b) và bảo quản dung dịch dự trữ AEC ở 4oC trong bóng tối.

Sửa soạn dung dịch chất nhiễm sắc/chất nền (sửa soạn ngay trước khi sử dụng)

Pha dung dịch đệm sodium acetate 0,05 M, có pH 5,0 như sau: Hòa tan 4,1 g sodium acetate trong một lít nước cất. Điều chỉnh pH đến 5,0 bằng acid acdetic 100%.

Pha vào 1 ml dung dịch dự trữ AEC vào 19 ml dung dịch đệm sodium acetate 0,05 M.

Pha vào 10 µl H2O2 30% cho từng 20 ml dung dịch chất nhiễm sắc/chất nền.



Lọc dung dịch này qua lọc 5 µm.

o Gây nhiễm các tế bào bằng virus PRRS

  1. Pha vào từng giếng 50 µl một dung dịch chứa virus nồng độ 105 TCID50/ml, nhưng chừa ra hai giếng không gây nhiễm để làm đối chứng.

  2. Ủ các phiến này trong 18-24 giờ, ở 37oC trong buồng CO2 nồng độ 5%.

o Cố định các tế bào

  1. Đổ bỏ môi trường nuôi cấy và rửa các phiến một lần trong nước muối (saline).

  2. Gõ nhẹ các phiến vào một giấy thấm để loại bỏ dịch dư thừa và sau đó để khô các phiến (không đậy nắp) trong 45 phút ở 37oC.

  3. Làm lạnh các phiến (không đậy nắp) trong 45 phút ở -20oC. (Các phiến mà không sử dụng ngay để xét nghiệm phải được niêm kín và bảo quản ở -20oC).

  4. Ủ các tế bào trong 10 phút ở nhiệt độ phòng với paraformaldehyde lạnh 4% (trong đệm PBS). Cách khác, các tế bào này sẽ được cố định trong ethanol đông đá hoàn toàn trong 45 phút ở 5oC hay trong acetone 80% đông đá trong 45 phút.

  5. Đổ bỏ paraformaldehyde và rửa các phiến một lần trong nước muối.

o Sửa soạn các độ pha loãng huyết thanh trong một phiến dùng pha loãng

  1. Chia 180 µl của NaCl 0,5 M với 4% huyết thanh ngựa và 0,5% Twen 80, có pH 7,2 (dung dịch đệm), vào từng giếng của các hàng A và E của (các) phiến đệm (dummy plates).

  2. Chia 120 µl dung dịch đệm vào tất cả các giếng khác.

  3. Pha 20 µl huyết thanh xét nghiệm hay huyết thanh đối chứng vào các giếng của các hàng A và E (độ pha loãng 1/10), và lắc đều.

  4. Pha loãng huyết thanh bốn lần bằng chuyển 40 µl từ các hàng A và E sang các hàng B và F, và tiếp tục, để cho ra các độ pha loãng 1/40, 1/160 và 1/640.

o Ủ huyết thanh trong phiến đã có đại thực bào cố định

  1. Chuyển 50 µl từ mỗi giếng của (các) phiến đệm vào các giếng tương ứng của phiến đã có đại thực bào cố định. Đậy (các) phiến này lại và ủ trong 1 giờ ở 37oC.

  2. Đổ bỏ dung dịch huyết thanh và rửa (các) phiến ba lần bằng NaCl 0,15 M + Tween 80 0,5%.

o Ủ với dung dịch kết hợp (conjugate)

  1. Pha loãng kết hợp HRPO thỏ-kháng-heo (hay kháng-chuột, nếu phiến phân lập với MAb), thành độ pha loãng xác định trước trong NaCl 0,15 M + Tween 80 0,5%. Thêm 50 µl dịch pha loãng này vào từng giếng của (các) phiến. Đậy (các) phiến và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Rửa các phiến này ba lần.

o Phương pháp nhuộm

  1. Chia 50 µl dung dịch chất nhiễm sắc/chất nền (AEC) đã lọc vào các giếng của (các) phiến (xem phụ chú 1).

  2. Ủ với dung dịch AEC này trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.

  3. Thay thế dung dịch AEC bằng 50 µl sodium acetate 0,05 M, có pH 5,0 (xem phụ chú 1).

o Đọc và giải thích các kết quả

Nếu các kháng thể là hiện diện trong huyết thanh đem xét nghiệm, bào tương của khoảng 30-50% các tế bào trong một giếng được nhuộm màu đỏ đậm bởi chất nhiễm sắc. Một huyết thanh âm tính được nhận biết do bào tương vẫn không bắt màu. Một huyết thanh có phản ứng không đặc hiệu sẽ nhuộm màu tất cả các tế bào trong một giếng (so sánh với huyết thanh dương tính đối chứng). Hiệu giá của huyết thanh được thể hiện là mẫu số của độ pha loãng cao nhất mà nhuộm màu 50% tế bào hay nhiều hơn trong các giếng. Một huyết thanh với hiệu giá <10 được coi là âm tính. Một huyết thanh với hiệu giá từ 10 đến 40 được coi là dương tính yếu. Thường màu nhuộm không đặc hiệu được phát hiện thấy ở những độ pha loãng này. Một huyết thanh với hiệu giá ≥160 được coi là dương tính.



b) Phát hiện các kháng thể bằng xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Mặc dù hiện nay không có xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang chuẩn đơn giản có thể chấp nhận được, nhưng một số giao thức đã được phát triển và được áp dụng tại các phòng thí nghiệm khác nhau ở Bắc Mỹ. IFA (indirect immunofluorescence assay) có thể thực hiện trên các phiến vi hiệu giá hay các phiến tám buồng sử dụng lớp tế bào MARC-145 và một lớp tế bào MARC-145 thích ứng cho phân lập virus PRRS. Để ngăn ngừa phản ứng chéo với pestivirus, khuyến cáo rằng các tết bào này và FBS, để bổ sung cho môi trường nuôi cấy, đều phải sạch pestivirus. Sau một thời gian ủ cấy, các tế bào đã gây nhiễm virus PRRS được cố định và sử dụng làm tế bào nền cho huyết thanh học. Các mẫu huyết thanh được xét nghiệm ở độ pha loãng duy nhất là 1/20 và các mẫu được báo cáo là dương tính hay âm tính tại độ pha loãng này. Từng huyết thanh heo đem xét nghiệm sẽ được pha vào các giếng hay các buồng chứa các tế bào đã gây nhiễm virus PRRS. Các kháng thể kháng virus PRRS, nếu hiện diện trong huyết thanh, sẽ kết hợp với các kháng nguyên trong bào tương của các tế bào bị nhiễm. Sau bước này, một kết hợp kháng IgG-heo kết hợp với màu huỳnh quang được pha vào, kết hợp này sẽ kết hợp với các kháng thể của heo vốn đã kết hợp với các kháng nguyên của virus PRRS trong các tế bào bị nhiễm. Các kết quả được đọc bằng kính hiểm vi huỳnh quang. Các phiến vi hiệu giá cũng có thể được chuẩn bị cho mục đích chuẩn độ huyết thanh (xem Đoạn b1 dưới đây).



o Cấy giống và gây nhiễm cho các tế bào MARC-145 trong các phiến vi hiệu giá

  1. Pha 50 µl môi trường nuôi cấy tế bào (như môi trường tối thiểu – Minimal Essential Medium [MEM] có chứa 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 100 IU penicilline và 100 µg streptomycin) không có FBS, vào từng giếng của các cột 2, 4, 6, 8, 10 và 12 của phiến 96 giếng sử dụng một máy hút đa kênh (multichannel pipettor).

  2. Các tế bào MARC-145 đã tiêu hóa bằng trypsine (trypsinise confluent) sẽ đem sử dụng để cấy giống vào các phiến vi hiệu giá 96 giếng và tái hòa tan các tế bào này trong FBS 8% ở thành một hàm lượng từ 100.000 – 125.000 tế bào/ml. Các tế bào MARC-145 này được tiêu hóa trypsine từ các bình nuôi cấy cho IFA một tuần một lần sử dụng trypsin/EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid) và được cấy giống trong các bình nuôi cấy ở một hàm lượng từ 250.000 tế bào/ml. Sau 4 ngày trong bình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy tế bào mới chứa FBS 2% được thêm vào cho 3 ngày tiếp theo.

  3. Sử dụng một máy hút đa kênh, pha 150 µl dịch chứa tế bào này vào từng giếng của phiến 96 giếng.

  4. Pha virus PRRS trong MEM mà không có FBS thành 102,2 TCID50/50 µl và phân phối 50 µl vào từng giếng của các cột 1, 3, 5, 7, 9 và 11.

  5. Ủ các phiến này trong khoảng 48-72 giờ ở 37oC trong buồng ẩm có CO2 5% để thu được một đơn lớp với khoảng 40-50% các tế bào bị nhiễm theo xác định bằng miễn dịch huỳnh quan gián tiếp. Cách khác, các phiến vi hiệu giá có thể lúc đầu được cấy giống bằng dung dịch chứa tế bào MARC-145 (thí dụ hàm lượng từ 100.000 tế bào/ml trong môi trường được bổ sung 5-10% FBS) và đã được ủ đến 72 giờ cho đến khi các tế bào này kết dính. Sau đó các thể tích 50 µl chế phẩm có virus PRRS này (thí dụ 105 TCID50/ml) được pha vào từng giếng và các phiến được ủ thêm 48-72 giờ trước khi đem cố định. Việc sử dụng chất đệm hữu cơ như HEPES trong môi trường đã cho thấy ổn định được pH khi buồng ủ CO2 không sẵn có.

o Cấy giống và gây nhiễm cho các tế bào MARC-145 trong các phiến kính tám buồng

  1. Pha 500 µl dung dịch chứa tế bào MARC-145 (thí dụ dung dịch MEM được bổ sung 10% FBS) với hàm lượng 100.000 tế bào/ml, vào từng buồng của phiến kính tám buồng.

  2. Ủ các tế bào này trong khoảng 48-72 giờ ở 37oC trong buồng ẩm có CO2 5% cho đến khi chúng kết dính.

  3. Pha vào mỗi buồng 50 µl dung dịch chứa virus PRRS hàm lượng 105 TCID50/ml và ủ các tế bào này thêm khoảng 18 giờ ở 37oC trong buồng ẩm có CO2 5%. Vào thời điểm này có thể quan sát thấy 15-20 tế bào bị nhiễm bằng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp.

o Cố định các tế bào

  1. Đổ bỏ môi trường, rửa một lần bằng PBS và đổ bỏ PBS. Với các buồng của phiến kính, gỡ các vách plastic của các buồng, giữ lại phần ron đệm.

  2. Thêm các thể tích 150 µl acetone lạnh (4oC) (80% trong nước) vào từng giếng của phiến 96 giếng. Ủ các phiến này ở 4oC trong 30 phút. Với các buồng của phiến kính, dùng acetone (80-100%) có nhiệt độ phòng, để cố định các tế bào trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng. Một số nhãn hiệu sản xuất của acetone sẽ làm phân hủy miếng ron đệm trong phiến kính. Do đó khuyến cáo rằng phải kiểm tra acetone trước khi sử dụng cho thao tác cố định.

  3. Đổ bỏ acetone và để khô các phiến hay các phiến kính ở nhiệt độ phòng.

  4. Các phiến này sau đó được đạt vào một giỏ plastic, được niêm kín và bảo quản ở -70oC cho đến khi sử dụng. Các buồng phiến kính có thể bảo quản tương tự trong các hộp chứa.

o Sửa soạn các độ pha loãng huyết thanh

  1. Pha các mẫu huyết thanh thành độ pha loãng 1/20 trong (0,01 M; pH 7,2) trong các phiến 96 giếng riêng biệt (thí dụ pha 190 µl PBS sử dụng một máy hút đa kênh vào 10 µl huyết thanh sẽ đem xét nghiệm).

  2. Gồm có các kháng thể đối chứng tham chiếu với virus PRRS thể hiện dương tính và âm tính mà đã biết được hiệu giá.

o Ủ huyết thanh vào các tế bào MARC-145 đã được cố định

  1. Các phiến đã được bảo quản được lấy ra khỏi đông lạnh -70oC và khi các phiến này đạt đến nhiệt độ phòng, tái hợp nước các tế bào này với 150 µl PBS trong vài phút. Đổ bỏ PBS bằng lật ngược các phiến và thấm khô bằng giấy thấm. Các tế bào của các phiến kính tám buồng thì không đem tái hợp nước.

  2. Thêm các thể tích 50 µl của từng độ pha loãng huyết thanh trước đó vào một giếng đã cố định các tế bào không gây nhiễm và vào một giếng đã cố định các tế bào có gây nhiễm. Thêm các thể tích tương tự của từng huyết thanh vào một buồng.

  3. Thêm các thể tích 50 µl các độ pha loãng của huyết thanh đối chứng dương tính và huyết thanh đối chứng âm tính theo cách thức như trên.

  4. Ủ các phiến đã đậy nắp trong 37oC trong 30 phút trong khí quyển ẩm. Các phiến kính sẽ được ủ tương tự trong các hộp hay các khay chứa phiến kính có nắp đậy.

  5. Đổ bỏ các huyết thanh mẫu và thấm khô các phiến bằng giấy thấm. Rửa sáu lần sử dụng tổng cộng 200 µl PBS. PBS này được pha vào từng giếng, sau đó lật ngược các phiến để đổ bỏ PBS. Sau khi đổ bỏ các mẫu huyết thanh, các phiến kính được rửa tiếp bằng PBS trong 10 phút.

o Ủ cấy với thành phần kết hợp (conjugate)

  1. Pha các thể tích 50µl kháng huyết thanh thỏ hay dê kháng IgG (kháng các chuỗi nặng và nhẹ của IgG) của heo đã được kết hợp với FITC (fluorescein isothiocyanate), vào từng giếng, bằng cách sử dụng máy hút đa kênh. Các thể tích tương tự được pha vào từng buồng riêng của phiến kính tám buồng.

  2. Ủ các phiến hay các phiến kính với nắp đậy kín, ở 37oC trong 30 phút trong không khí ẩm.

  3. Đổ bỏ thành phần kết hợp ra khỏi các phiến và thấm khô các phiến này bằng giấy thấm. Rửa tổng cộng bốn lần bằng PBS như đã mô tả phần trên. Với các phiến kính, đổ bỏ thành phần kết hợp, xả bằng PBS, rửa trong 10 phút trong PBS và xả trong nước cất. Ép các phiến kính trên một tấm giấy thấm để loại bớt nước.

  4. Các phiến và phiến kính này được đọc bằng cách dùng kính hiển vi huỳnh quang.

o Đọc và giải thích các kết quả

Sự hiện diện của huỳnh quang xanh lá trong bào tương của các tế bào đã bị nhiễm, và sự vắng mặt của dấu hiệu này trong các tế bào không bị nhiễm cho thấy sự hiện diện của các kháng thể đối với virus PRRS trong huyết thanh ở độ pha loãng đem xét nghiệm. Chỉ số mật độ của huỳnh quang có thể thay đổi theo hàm lượng của kháng thể đặc hiệu với virus PRRS hiện diện trong huyết thanh được xét nghiệm.

Sự vắng mặt của huỳnh quang xanh lá trong cả các tế bào đã bị nhiễm lẫn không bị nhiễm được giải thích là sự vắng mặt của kháng thể kháng virus PRRS có trong huyết thanh được đem xét nghiệm. Xét nghiệm này phải được lặp lại nếu huỳnh quang không phát hiện thấy khi sử dụng huyết thanh đối chứng dương tính trên các tế bào đã bị nhiễm. Huỳnh quang phải không phát hiện thấy trong các tế bào không bị nhiễm với bất kỳ huyết thanh đối chứng nào. Mọi huyết thanh đem xét nghiệm cho ra các kết quả nghi ngờ sẽ được xét nghiệm lại ở độ pha loãng 1/20 và nếu các kết quả vẫn chưa rõ, thì phải lấy mẫu lại trên con thú để xét nghiệm lại.

b1) Đánh giá bằng IFA của huyết thanh cho các hiệu giá kháng thể

Các phiến vi hiệu giá và IFA cũng có thể được sử dụng cho các mục đích chuẩn độ hiệu giá huyết thanh. Có đến 16 huyết thanh có thể được chuẩn độ hiệu giá trên mỗi phiến 96 giếng.



  1. Cấy vào các phiến vi hiệu giá 96 giếng bằng các tế bào MARC-145 và ủ ở 37oC trong buồng ẩm có 5% CO2 cho đến khi các tế bào kết bám.

  2. Cấy vào các giếng chế phẩm có virus PRRS, ngoại trừ các giếng của các cột 1, 6 và 11, và ủ các phiến này ở 37oC trong buồng ẩm có 5% CO2 trong 48-72 giờ.

  3. Đổ bỏ môi trường nuôi cấy và rửa xả các lớp tế bào đơn một lần bằng PBS (0,01 M, pH 7,2). Cố định các lớp tế bào đơn bằng acetone lạnh (dung dịch lỏng 80%) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ bỏ acetone, để các phiến này khô trong không khí và bảo quản các phiến này có nắp đậy ở -20oC cho bảo quản ngắn hạn hoặc -70oC cho bảo quản dài hạn.

  4. Pha loãng thành chuỗi cho huyết thanh bao gồm huyết thanh đối chứng dương tính với virus PRRS, pha loãng gấp bốn lần trong PBS, bắt đầu ở 1/16 hay 1/20. Pha loãng huyết thanh đối chứng âm tính ở độ pha loãng 1/16 hay 1/20. Chia từng 50 µl của từng độ pha loãng (1/16, 1/64, 1/256, 1/1024 hay 1/20, 1/80, 1/320, 1/1280) trong các giếng có chứa kháng nguyên virus của các cột 2, 3, 4, 5 hay 7, 8, 9, 10. Với từng huyết thanh, cũng chia 50 µl của độ pha loãng 1/16 hay 1/20 trong các giếng đối chứng của các cột 1 và 6. Tương tự, chia các độ pha loãng của huyết thanh đối chứng dương tính và âm tính trong các giếng của cột 11 và 12.

  5. Ủ các phiến ở 37oC trong 30 phút trong buồng ẩm. Đổ bỏ huyết thanh và rửa xả các phiến ba lần bằng PBS.

  6. Pha thêm 50 µl thành phần kết hợp đã được pha loãng của huyết thanh kháng IgG của heo đã được kết hợp với FITC và ủ các phiến này ở 37oC trong 30 phút trong buồng ẩm. Đổ bỏ thành phần kết hợp này, rửa xả các phiến này vài lần và ép trong chất liệu thấm hút để loại bỏ nước dư thừa.

o Đọc và giải thích các kết quả

Sau khi kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang, hiệu giá của huyết thanh được ghi nhận là mẫu số của độ pha loãng cao nhất mà quan sát thấy được một cách điển hình huỳnh quang trong bào tương. Để so sánh các mẫu huyết thanh, sự gia tăng gấp bốn lần hiệu giá trong vòng 2 tuần cho thấy rằng bệnh nhiễm đang hoành hành trong một cá thể thú vật. Không phát hiện thấy huỳnh quang điển hình trong huyết thanh đem xét nghiệm hay huyết thanh đối chứng âm tính và dương tính ở các tế bào đối chứng không bị nhiễm. Không phát hiện thấy huỳnh quang trong các tế bào đã bị nhiễm với huyết thanh đối chứng âm tính. Phải phát hiện thấy huỳnh quang đặc trưng trên các tế bào đã bị nhiễm với huyết thanh đối chứng dương tính ở các độ pha loãng thích hợp. Điển cuối của IFA có thể khác nhau giữa các phòng thí nghiệm. Các kết quả xét nghiệm cũng có thể khác nhau tùy theo dòng virus PRRS được sử dụng trong xét nghiệm vì chúng có tính kháng nguyên khác nhau.



c) Phát hiện các kháng thể bằng xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (ELISA)

Một số phòng thí nghiệm đã phát triển các xét nghiệm ELISA (gián tiếp hay ghép khối – indirect or blocking) cho xét nghiệm huyết thanh học (1, 6, 8, 14, 25). Đã có một dạng xét nghiệm ELISA ghép khối kép (double-blocking ELISA) có thể phân biệt giữa các phản ứng huyết thanh học đối với các dạng kháng nguyên của Châu Âu và Bắc Mỹ (25). Các bộ kit ELISA hiện có sẵn trên thị trường để xác định tình trạng huyết thanh của heo đối với PRRS. Những bộ kit này sử dụng một cách riêng biệt các kháng nguyên của cả các chủng virus PRRS của Châu Âu lẫn Bắc Mỹ, hoặc có thể là kết hợp các kháng nguyên này. Lợi thế chủ yếu của các bộ kit này là nhanh chóng xử lý số lượng lớn các mẫu. Các xét nghiệm ELISA thương mại sử dụng các proteins tái tổ hợp của cả hai chủng virus PRRS làm các kháng nguyên cũng đã được phát triển và sẵn có trên thị trường.



C. CÁC YÊU CẦU ĐỐI VỚI CÁC LOẠI VACCIN VÀ CÁC CHẨN ĐOÁN SINH HỌC

Các loại vaccin virus PRRS sống đã được biến đổi (modified-live – MLV) đã sẵn có trên thị trường của nhiều quốc gia để kiểm soát các dạng rối loạn sinh sản và/hoặc hô hấp của PRRS. Ở Mỹ và Châu Âu, một vaccin chết đã được cấp phép để giúp giảm tỷ lệ xảy thai và heo con yếu ớt do dạng rối loạn sinh sản của PRRS. Tất cả các loại vaccin PRRS hiện nay được cấp phép ở Mỹ chứa dạng kháng nguyên Bắc Mỹ và các loại vaccin khác là dạng kháng nguyên Châu Âu. Hình như hầu hết lợi ích từ sử dụng vaccin là do virus của vaccin có tính kháng nguyên rất giống với virus thực địa (29). Tuy nhiên sử dụng vaccin cho heo không thể ngăn ngừa được bệnh nhiễm virus PRRS, vaccin chỉ có thể có ích cho các đàn đã từng bị nhiễm bệnh PRRS hay những đàn có nguy cơ bị nhiễm virus PRRS. Các vaccin virus sống đã được biến đổi có khuynh hướng không sử dụng cho các đàn chưa từng mắc bệnh, heo nái mang thai hay heo nái hậu bị hay heo nọc trong thời kỳ sinh sản. Các vaccin virus sống đã biến đổi có khuynh hướng sử dụng cho heo nái và heo hậu bị từ 3-6 tuần trước khi phối giống và cho heo con từ 3 tuần tuổi hay lớn hơn và giúp giảm tỷ lệ bệnh do PRRS. Virus của vaccin có thể tồn tại trong heo nọc và được thải tiết qua tinh dịch (7). Virus đã được biến đổi của vaccin có thể được thải tiết và lây truyền đến các heo chưa được tiêm phòng, qua tiếp xúc (27). Các hướng dẫn về chế tạo các vaccin thú y được nêu trong Chương 1.1.8 Các nguyên tắc về chế tạo vaccin thú y. Các hướng dẫn được nêu trong chương này và trong Chương 1.1.8 đều là định hướng chung và có thể được bổ sung bởi các quy định của quốc gia hay vùng.



1. Quản lý giống

a) Phân loại giống

Dòng phân lập của virus PRRS được sử dụng cho chế tạo vaccin phải được kèm theo một lý lịch về nguồn gốc của chúng và lịch sử cấy truyền. Dòng phân lập này phải an toàn trong heo với lứa tuổi cần được tiêm phòng và cho ra bảo hộ thật sự. Các dòng phân lập của vaccin virus sống đã được biến đổi phải thể hiện không tái chuyển đổi trở nên có độc lực sau khi cấy truyền qua các động vật ký chủ.



b) Phương pháp nuôi cấy

Virus PRRS được nhân giống liên tục trong lớp tế bào của thận khỉ Châu Phi, như MA-104 hay Vero. Việc nhân giống virus không được quá năm lần từ virus giống gốc (master seed virus – MSV) trừ khi chứng minh được những lần nhân giống tiếp theo cho được bảo hộ trên heo.



c) Đánh giá là một vaccin

Virus giống gốc (MSV) phải sạch khỏi vi khuẩn, nấm và mycoplasma. MSV này phải được xét nghiệm về sạch đối với các virus ngoại lai, bao gồm virus bệnh dạ dày ruột truyền nhiễm (transmissible gastroenteritis virus), adenovirus của heo, circovirus type 1 và 2 của heo, virus gây viêm não và đông vón máu heo (porcine haemagglutinating encephalitis virus), parvovirus của heo, tất cả các loại pestiviruses, reovirus, và virus bệnh dại, bằng kỹ thuật kháng thể huỳnh quang. MSV này phải sạch đối với các virus ngoại lai bằng xét nghiệm bệnh tích tế bào (CPE) và hấp phụ hồng cầu (haemadsorption) trên lớp tế bào Vero và dạng tế bào phôi heo.

Các dòng phân lập của virus PRRS nhược độc được biết là gây nhiễm virus huyết và sẽ truyền lây đến các thú vật mẫn cảm. MSV này phải thể hiện không độc lực đối với heo con và thú vật mang thai, bằng loạt cấy truyền năm lần (có thể đến 10 lần tùy theo quốc gia) giống virus gốc, qua heo mẫn cảm sử dụng con đường gây nhiễm thường xuyên nhất.

Trong một thử nghiệm tạo miễn dịch, giống virus gốc này ở lần cấy truyền cao nhất dùng để chế tạo vaccin, phải tạo bảo hộ cho heo mẫn cảm kháng lại được dòng độc lực, dòng không tương đồng (heterologous challenge strain). Với dạng hô hấp, heo con ba tuần tuổi được tiêm vaccin chế tạo bằng dạng cấy truyền cao nhất của virus giống gốc. Những heo con này được thử thách với một dòng độc lực của virus PRRS vào tuần từ 2-16 để xác định bảo hộ đối với các dấu hiệu hô hấp của PRRS. Để xác định bảo hộ đối với thiệt hại do dạng rối loạn sinh sản của PRRS, các con thú đã được tiêm phòng được thử nghiệm ở khoảng 85 ngày của thai kỳ. Số liệu thống kê khác biệt rõ rệt phải cho thấy có bảo hộ đối với các dấu hiệu của bệnh sinh sản, bao gồm chết thai, đẻ non và/hoặc heo con yếu ớt, khi so sánh với các đối chứng. Các thực nghiệm trên thực địa phải được thực hiện để xác định tính an toàn của vaccin. Các heo chỉ báo không có tiêm phòng phải được đặt trong từng vị trí để theo dõi sự thải tiết của virus nhược độc này.



2. Phương pháp chế tạo vaccin

Lớp tế bào thận khỉ Châu Phi được cấy vào trong các bình thích hợp. Sử dụng MEM được bổ sung FBS làm môi trường cho chế tạo vaccin; FBS phải sạch không có pestivirus hay các kháng thể đối với pestivirus và sạch khỏi nguy cơ về bệnh viêm não nhũn não bò (bệnh BSE). Ủ tế bào ở 37oC.

Các tế bào nuôi cấy này được cấy trực tiếp bằng giống virus PRRS dùng chế tạo vaccin, mà giống này thường là từ virus giống gốc (MSV) trải qua nhân giống từ 1 đến 4 lần. Các tế bào nuôi cấy đã được cấy virus đem ủ từ 1-8 ngày trước khi thu hoạch lấy môi trường nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, theo dõi hàng ngày về tác động gây bệnh tích tế bào và vấy nhiễm vi khuẩn.

Các vaccin virus chết được làm bất hoạt bằng hóa chất hoặc là formaline hay binary ethylenimine và được trộn với phụ gia thích hợp. Các vaccin virus sống đã được biến đổi thường được trộn với một chất tạo ổn định trước khi đóng chai và tạo dạng tiềm sinh. Nếu có sử dụng formaline làm tác nhân gây bất hoạt, thành phẩm phải được thử nghiệm đối với tồn dư nồng độ formaldehyde và nồng độ này không được quá 0,74 g/lít.



3. Kiểm soát trong sản xuất

Các lô virus PRRS sản xuất ra phải được chuẩn độ hiệu giá trong mô nuôi cấy, để chuẩn độ cho sản phẩm. Các lô hiệu giá thấp có thể được cô đậm hay được phối trộn với các lô hiệu giá cao để đạt được hiệu giá theo yêu cầu.



4. Kiểm tra lô hàng

Các mẫu thành phẩm phải được xét nghiệm về tính tinh khiết, tính an toàn và hiệu lực. Các chai chứa virus gốc còn sống ở dạng tiềm sinh cũng phải được xét nghiệm về hàm lượng ẩm tối đa cho phép.



a) Tính tinh khiết (Purity)

Các mẫu được kiểm tra về vấy nhiễm vi khuẩn, nấm và pestivirus. Để xét nghiệm về vi khuẩn, mười bình chứa, mỗi bình chứa 120 ml môi trường casein đậu nành đã được tiêu hóa, được cấy vào 0,2 ml từ mười chai mẫu thành phẩm. Mười bình chứa này được ủ từ 30-35oC trong 14 ngày và được quan sát phát hiện vi khuẩn phát triển. Để xét nghiệm về nấm, mười bình chứa, mỗi bình chứa 40 ml môi trường casein đâu nành đã được tiêu hóa, được cấy vào 0,2 ml từ 10 chai mẫu thành phẩm. Các bình này được ủ ở 20-25oC trong 14 ngày và được quan sát phát hiện phát triển của nấm.



b) Tính an toàn (Safety)

Các xét nghiệm về tính an toàn có thể kết hợp thực hiện trong chuột lang, chuột bạch hay heo.



c) Tính hiệu quả (Potency)

Các mẫu thành phẩm của một vaccin virus sống đã được biến đổi đều được chuẩn độ hiệu giá (log10) trong các phiến vi hiệu giá để xác định hiệu giá của virus.



o Phương pháp xét nghiệm

  1. Sửa soạn các độ pha loãng mười lần từ 10-1 đến 10-5 bằng cách sử dụng 0,2 ml vaccin đem xét nghiệm đã được tái hợp nước và 1,8 ml MEM. Một đối chứng dương tính của virus PRRS đã được chuẩn độ thành các hàm lượng thích hợp.

  2. Cấy 0,1 ml/giếng từ mỗi độ pha loãng vào năm giếng của phiến 96 giếng có chứa lớp tế bào thận khỉ Châu Phi.

  3. Ủ phiến 96 giếng này ở 37oC trong không khí có CO2 trong 5-7 ngày.

  4. Đọc các phiến bằng vi thể để phát hiện tác động gây bệnh tích tế bào. Đối chứng dương tính với virus PRRS sẽ cho hiệu giá trong vòng 0,3 log10 TCID50 từ phương cách đã xác định trước đó.

  5. Xác định TCID50/liều bằng phương pháp Spearman–Kärber. Hiệu giá cho ra phải ít nhất 1,2 log cao hơn hiệu giá được sử dụng trong thử nghiệm sinh miễn dịch. 1,2 log này bao gồm 0,5 log cho tính ổn định suốt thời gian tồn tại của sản phẩm và 0,7 log cho tính khác biệt về hiệu lực.

Các vaccin virus chết có thể áp dụng tiêm vaccin/xét nghiệm huyết thanh học cho thú vật ký chủ hay thú vật phòng thí nghiệm, hoặc xét nghiệm tiêm vaccin/thử nghiệm để xác định hiệu lực của thành phẩm. Các xét nghiệm song song sử dụng các kỹ thuật ELISA định lượng kháng nguyên để so sánh với một chuẩn của thành phẩm là chấp nhận được trong xác định hiệu lực tương ứng của một sản phẩm. Chuẩn này phải thể hiện sẽ tạo được bảo hộ trong thú vật ký chủ.

d) Độ dài miễn dịch

Các nghiên cứu độ dài thời gian miễn dịch được thực hiện trước khi vaccin được cấp phép. Với dạng hô hấp của PRRS, độ dài thời gian miễn dịch này phải kéo dài đến tuổi giết mổ được trên heo. Độ dài thời gian miễn dịch cho dạng sinh sản phải kéo dài đến khi cai sữa cho heo con.



e) Tính ổn định (Stability)

Tất cả các vaccin đều cần có thời gian tồn tại 24 tháng trước khi hết hạn dùng. Các nghiên cứu về tính ổn định theo thời gian thực được thực hiện để xác nhận tính phù hợp của hạn dùng này.



f) Các chất bảo quản (Preservatives)

Các chất kháng sinh được pha vào trong quá trình sản xuất, thường là gentamicin sulphate hay neomycin, không quá 30 µg/ml.



g) Các cảnh báo (các tác hại)

Ở đây không có nguy cơ về tái chuyển đổi thành độc lực khi sử dụng các loại vaccin đã được làm bất hoạt hoàn toàn. Tuy nhiên, đó không phải là trường hợp của các loại vaccin virus sống đã làm biến đổi. Để giảm nhẹ nguy cơ này, việc sử dụng vaccin sống đã làm biến đổi chỉ được khuyến cáo cho các đàn có dương tính với virus PRRS như là phương tiện giúp giảm đi các bệnh có liên quan đến dạng rối loạn hô hấp và/hoặc sinh sản của PRRS. Vaccin virus sống đã làm biến đổi không khuyến cáo sử dụng cho nái mang thai và nái hậu bị, hoặc sử dụng cho nọc giống. Vaccin virus sống đã làm biến đổi đầu tiên cho PRRS dựa vào chủng virus Bắc Mỹ đã được báo cáo là virus này có lây lan sang các con heo chưa tiêm phòng (3, 27) và sau đó gây ra rối loạn sinh sản trong PRRS do virus của vaccin trong các đàn đã bị nhiễm (3, 21). Điều này cũng dựng nên bằng chứng rằng các loại vaccin virus sống đã làm biến đổi, của chủng Châu Âu, cũng có thể làm lây lan virus đến các con heo không tiêm phòng và cũng có thể xuyên qua nhau thai và gây cho heo con mắc bệnh bẩm sinh (24).



5. Các xét nghiệm trên vaccin thành phẩm

a) Tính an toàn (Safety)

Xem Đoạn C.4.b.



b) Tính hiệu lực (Potency)

Xem đoạn C.4.c.



THAM KHẢO

1. ALBINA E., LEFORBAN Y., BARON T., PLANA DURAN J. & VANNIER P. (1992). An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. Ann. Rech. Vet., 23, 167–176.

2. BENFIELD D.A., COLLINS J.E., DEE S.A., HALLBUR P.G., JOO H.S., LAGER K.M., MENGELING W.L., MURTAUGH M.P., ROSSOW K.D., STEVENSON G.W. & ZIMMERMAN J.J. (1999). Porcine reproductive and respiratory syndrome. In: Diseases of Swine, Eight Edition, Straw B.E., D’Allaire S., Mengeling W.L. & Taylor D.J., eds. Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA, 201–232.

3. BOTNER A., STRANDBYGAARD B., SORENSEN K.J., HAVE P., MADSEN K.G., MADSEN E.S. & ALEXANDERSEN S. (1997). Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine. Vet. Rec., 141, 497–499.

4. BRINTON M.A., GODENY E.K., HORZINEK M.C., MEULENBERG J.J.M., MURTAUGH M.P., PLAGEMANN P.G.W. & SNIJDER E.J. (2000). Arteriviridae. In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R. & Wickner R.B., eds. Academic Press, San Diego, USA, 851–857.

5. CHANG C.C., YOON K.J., ZIMMERMAN J.J., HARMON K.M., DIXON P.M., DVORAK C.M. & MURTAUGH M.P. (2002). Evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus during sequential passages in pigs. J. Virol., 76, 4750–4763.

6. CHO H.J., MCNAB B., DUBUC C., JORDAN L., AFSHAR A., MAGAR R., PRINS S. & EERNISSE K. (1997). Comparative study of serological methods for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Can. J. Vet. Res., 61, 161–166.

7. CHRISTOPHER-HENNINGS J., NELSON E.A., NELSON J.K. & BENFIELD D.A. (1997). Effects of a modified-live virus vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome in boars. Am. J. Vet. Res., 58, 40–45.

8. DENAC H., MOSER C., TRATSCHIN J.D. & HOFMANN M.A. (1997). An indirect ELISA for the detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen. J. Virol. Methods, 65, 169–181.

9. DREW T.W. (1995). Comparative serology of porcine reproductive and respiratory syndrome in eight European laboratories, using immunoperoxidase monolayer assay and enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 14(3), 761–775.

10. FANG Y., KIM D.Y., ROPP S., STEEN P., CHRISTOPHER-HENNINGS J., NELSON E.A. & ROWLAND R.R.R. (2004). Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in the United States. Virus Res., 100 (2), 229–235.

11. GILBERT S.A., LAROCHELLE R., MAGAR R., CHO H. J. & DEREGT D. (1997). Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses by a multiplex PCR assay. J. Clin. Microbiol., 35, 264–267.

12. HALBUR P.G., ANDREWS J.J. HUFFMAN E.L., PAUL P.S., MENG X.-J. & NIYO Y. (1994). Development of a streptavidin-biotin immunoperoxidase procedure for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigen in porcine lung. J. Vet. Diagn. Invest., 6, 254–257.

13. HALBUR P.G., PAUL P.S., FREY M.L., LANDGRAF J., EERNISSE K., MENG X.-J., LUM M.A., ANDREWS J.J. & RATHJE J.A. (1995). Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus. Vet. Pathol., 32, 648–660.

14. HOUBEN S., CALLEBAUT P. & PENSAERT M.B. (1995). Comparative study of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay and the immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs. J. Virol. Methods, 51, 125–128.

15. DEA S., GAGNON C.A., MARDASSI H. & MILANE G. (1996). Slow-reacting and European strains of porcine reproductive and respiratory (PRRS) virus. J. Vet. Med. Sci., 58, 749–753.

16. KIM H.S., KWANG J., YOON I.J., JOO H.S. & FREY M.L. (1993). Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line. Arch. Virol., 133, 477–483.

17. KLEIBOEKER S.B., SCHOMMER S.K., LEE S.M., WATKINS S., CHITTICK W., POLSON D. (2005). Simultaneous detection of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus using realtime quantitative reverse transcriptase-PCR. J. Vet. Diagn. Invest., 17,165–170.

18. DREW T.W. (1995). Comparative serology of porcine reproductive and respiratory syndrome in pigs. J. Vet. Med. Sci., 58, 941–946.

19. LAROCHELLE R. & MAGAR R. (1995). Production, characterization and reactivity of monoclonal antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol., 76, 1361–1369.

20. LAROCHELLE R., MAGAR R. (1997). Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses by in situ hybridization. J. Virol. Methods, 68, 161–168.

21. MADSEN K.G., HANSEN C.M., MADSEN E.S., STRANDBYGAARD B., BOTNER A. & SORENSEN K.J. (1998). Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigen in porcine lung. J. Vet. Diagn. Invest., 6, 254–257.

22. MARDASSI H., WILSON L., MOUNIR S. & DEA S. (1994). Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and efficient differentiation between Canadian and European strains by reverse transcription and PCR amplification. J. Clin. Microbiol., 32, 2197–2203.

23. NODELIJK G., WENSVOORT G., KROESE B., VAN LEENGOED L., COLIJN E. & VERHEIJDEN J. (1996). Comparison of a commercial ELISA and an immunoperoxidase monolayer assay to detect antibodies directed against porcine respiratory and reproductive syndrome virus. Vet. Microbiol., 49, 285–295.

24. SCORTTI M., PRIETO C., MARTINEZ-LOBO F.J., SIMARRO I. & CASTRO J.M. (2006). Effects of two commercial European modified-live vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in pregnant gilts. Vet. J., 172, 506–514.

25. JUSA E.R., INABA Y., KOUNO M., HIROSE O., SHIBATA I., KUBOTA M. & YASUHARA H. (1996). Slow-reacting and complement-requiring neutralizing antibody in swine infected with porcine reproductive and respiratory (PRRS) virus. J. Vet. Med. Sci., 58, 749–753.

26. STADEJEK T., OLEKSIEWICZ M.B., POTAPCHUK D. & PODGORSKA K. (2006). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains of exceptional diversity in eastern Europe support the definition of new genetic subtypes. J. Gen. Virol., 87, 1835–1841.

27. TORRISON J., KNOLL M. & WISEMAN B. (1996). Evidence of pig-to-pig transmission of a modified-live PRRS virus vaccine. Proc. Am. Assoc. Swine Practitioners, 89–91.

28. VAN VUGT J.J.F.A., STORGAARD T., OLEKSIEWICZ M.B. & BOTNER A. (2001). High frequency RNA recombination in porcine reproductive and respiratory syndrome virus occurs preferentially between parental sequences with high similarity. J. Gen. Virol., 82, 2615–2620.

29. LAROCHELLE R. & MAGAR R. (1997). Differentiation of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotypes by in situ hybridization. J. Virol. Methods, 68, 161–168.

30. LAROCHELLE R. & MAGAR R. (1997). Evaluation of the presence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by polymerase chain reaction. J. Virol. Methods., 47, 273–278.

31. WASILK A., CALLAHAN J.D., CHRISTOPHER-HENNINGS J., GAY T.A., FANG Y., DAMMEN M., REOS M.E., TORREMORELL M., POLSON D., MELLENCAMP M., NELSON E. & NELSON W.M. (2004). Detection of U.S., Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR. J. Clin. Microbiol., 42, 4453–4461.

32. MAGAR R., LAROCHELLE R., NELSON E.A. & CHARREYRE C. (1997). Differential reactivity of a monoclonal antibody directed to the membrane protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Can. J. Vet. Res., 61, 69–71.

33. WENSVOORT G., TERPSTRA C., POL J.M.A., TER LAAK E.A., BLOEMRAAD M., DE KLUYVER E.P., WENSVOORT G. & MOORMANN R.J.M. (1993). Lelystad virus, the isolation of Lelystad virus. Vet. Q., 13, 121–130.

34. WESLEY R.D., MENGELING W.L., LAGER K.M., CLOUSER D.F., LANDGRAF J.G. & FREY M.L. (1998). Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain from North American field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 5. J. Vet. Diagn. Invest. 10, 140–144.

35. YOON I.J., JOO H.S., CHRISTIANSON W.T., KIM H.S., COLLINS J.E., MORRISON R.B. & DIAL G.D. (1992). An indirect fluorescent antibody test for the detection of antibody to swine infertility and respiratory syndrome virus in swine sera. J. Vet. Diagn. Invest., 4, 144–147.



NB: There is an OIE Reference Laboratory for Porcine reproductive and respiratory syndrome (see Table in Part 3 of this Terrestrial Manual or consult the OIE Web site for the most up-to-date list: www.oie.int).


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2016
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương