Bệnh lở mồm long móng (fmd) là bệnh truyền lây mạnh nhất của thú có vú và có khả năng gây ra tổn thất kinh tế nặng nề trên chăn nuôi gia súc móng guốc mẫn cảm

Các kháng nguyên được chuẩn bị từ một dòng được chọn của virus FMD nuôi cấy trong các đơn lớp của tế bào BHK-21. Dịch phù nổi không tinh lọc được sử dụng và được chuẩn độ trước trong một chuỗi pha loãng gấp hai lần, nhưng không có huyết thanh. Độ pha loãng cuối cùng tốt nhất mà sau khi thêm vào thể tích tương đương dịch pha loãng (xem dưới đây), cho ra một chỉ số hấp phụ ở vùng trên của đồ thị hiệu giá (mật độ quan học khoảng 1,5). PBS chứa 0,05% Tween 20 và chỉ thị đỏ phenol được sử dụng làm dịch pha loãng (PBST). Các tác nhân thử khác được sử dụng trong xét nghiệm cũng giống như ở ELISA kết khối thể rắn. Một thí dụ về phương pháp xét nghiệm được mô tả dưới đây. Nhiệt độ và thời gian ủ có thể kháng nhau tùy theo giao thức.

1. 
   Các phiến ELISA được phủ 50 µl/giếng bằng kháng huyết thanh thỏ đối với kháng nguyên 14S sẽ được xét nghiệm và để qua đêm trong buồng ẩm ở nhiệt độ phòng.
   
2. 
   Các phiến ELISA được rửa ba lần bằng PBS.
   
3. 
   Trong các phiến nhiều giếng đáy bằng hình chữ U (các phiến chứa) sửa soạn 50 µl chuỗi huyết pha loãng gấp đôi của huyết thanh, bắt đầu từ 1/8. Với từng giếng, cho vào 50 µl kháng nguyên virus với liều không đổi mà tương ứng với kháng huyết thanh của thỏ đã phủ lên các phiến, hỗn hợp này được để qua đêm ở 4^oC, hay ủ ở 37^oC trong 1 giờ. Kháng nguyên thêm vào làm gia tăng độ pha loãng của huyết thanh thành 1/16.
   
4. 
   Sau đó chuyển 50 µl hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên từ phiến chứa sang các phiến ELISA đã được phủ huyết thanh thỏ và các phiến này được ủ ở 37^oC trong 1 giờ trong máy lắc vòng tròn (rotary shaker).
   
5. 
   Sau khi rửa, cho vào từng giếng 50 µl kháng thuyết thanh của chuột lang tương ứng với kháng nguyên virus đã sử dụng ở bước (iv) (tiền kết hợp với huyết thanh bò bình thường và đã pha loãng trong PBST có chứa 5% bột sữa tách béo). Sau đó các phiến này được ủ ở 37^oC trong 1 giờ trong máy lắc vòng tròn.
   
6. 
   Các phiến này lại được rửa và sau đó cho vào từng giếng 50 µl globulin miễn dịch của thỏ kháng với globilin miễn dịch của chuột lang đã được kết hợp với enzyme peroxidase của cây cải ngựa (horseradish peroxidase) (tiền kết hợp với huyết thanh bò bình thường và đã pha loãng trong PBST có chứa 5% sữa tách béo). Các phiến này được ủ ở 37^oC trong 1 giờ trong máy lắc vòng tròn.
   
7. 
   Các phiến này lại được rửa ba lần và cho vào từng giếng 50 µl dung dịch chất nền, có chứa 0,05% H₂O₂ cộng với orthophenylene diamine hay một chất màu thích hợp.
   
8. 
   Phản ứng được làm ngưng sau 15 phút bằng pha vào 50 µl acid suphuric 1M. Các phiến này được đọc ở 492 nm trong một quang phổ kế có kết nối với máy tính.
   
9. 
   Đối chứng: Tối thiểu bốn giếng chứa huyết thanh tham chiếu dương tính mạnh, dương tính yếu và âm tính ở độ pha loãng cuối cùng từ 1/32 phải bao gồm trong từng phiến cùng với số lượng tương đương các giếng đối chứng phản ứng (kháng nguyên) chỉ chứa kháng nguyên đã pha loãng mà không có huyết thanh. Với hiệu giá xét nghiệm cuối cùng, phải có chuỗi các độ pha loãng gấp hai của huyết thanh tham chiếu tương ứng của bò trong ít nhất một phiến cho mỗi lượt xét nghiệm.
   
10. 
    Giải thích các kết quả: Các hiệu giá kháng thể được biểu diễn là 50% hiệu giá cuối cùng, tức là độ pha loãng mà phản ứng của huyết thanh xét nghiệm cho ra mật độ quang học tương đương 50% ức chế của mật độ quang học trung bình của phản ứng (kháng nguyên) của các giếng đối chứng (38). Mật độ quang học trung bình được tính toán theo cách của hai giá trị giữa của các giếng phản ứng đối chứng, giữa giới hạn của các giá trị cao nhất và thấp nhất (cách khác, giá trị này có thể sử dụng sau khi thiết lập các giới hạn thích hợp để kiểm soát đối với biến thiên giữa các giếng). Thông thường, huyết thanh với các hiệu giá lớn hơn hay tương đương 1/90 được coi là dương tính. Hiệu giá dưới 1/40 được coi là âm tính. Để chứng nhận cho cá thể thú vật với mục đích giao thương quốc tế, các hiệu giá mà lớn hơn 1/40 nhưng thấp hơn 1/90 thì được coi là nghi ngờ, phải lấy thêm huyết thanh để xét nghiệm; các kết quả được coi là dương tính nếu kết quả xét nghiệm lần hai có hiệu giá từ 1/40 hay lớn hơn. Với các mục đích giám sát trên cơ sở đàn, như là một phần của đánh giá giám sát huyết thanh học, một ngưỡng từ 1/90 có thể thích hợp. Các hiệu giá ngưỡng cho đánh giá miễn dịch bảo hộ của vaccin đã được thiết lập từ kinh nghiệm của các kết quả xét nghiệm có tiềm năng với vaccin có liên quan với loài mục tiêu.
    

Kháng thể đối với các protein không cấu trúc (NSPs) thể hiện từ virus FMD tái tổ hợp (như 3A, 3B, 2B, 2C, 3ABC) có thể đo lường được bằng các định dạng ELISA khác nhau hay điện di miễn dịch (immunoblotting). Những ELISA này hoặc là sử dụng các kháng nguyên đã được tinh lọc được hấp phụ một cách trực tiếp đến các phiến vi hiệu giá, hay sử dụng các kháng thể đa giá hoặc đơn giá để bắt giữ các kháng nguyên đặc hiệu từ các chế phẩm nửa tinh lọc (semi-purified preparations) (14, 20, 42, 59). Phương pháp theo dõi chỉ số áp dụng trong Panaftosa được mô tả chi tiết dưới đây. Các ELISA giám tiếp và cạnh tranh khác phát hiện các kháng thể bò đối với 3ABC đã cho thấy có đặc tính chẩn đoán tương đương (17). Nghiên cứu tương tự bổ sung cho dữ liệu ban đầu từ Panaftosa cho thấy rằng đặc tính chẩn đoán của những xét nghiệm này là tương đương trên bò, cừu và heo.

• Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme gián tiếp (Indirect enzyme-linked immunosorbent assay)

• Chuẩn bị các kháng nguyên tái tổ hợp (xem Đoạn B.2.d Xét nghiệm thấm chuyển điện tích miễn dịch kết hợp enzyme [Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay] dưới đây)

1. 
   Phiến vi hiệu giá được phủ qua đêm ở 4^oC bằng 1 µg/ml kháng nguyên tan chảy 3ABC trong đệm carbonate/bicarbonate, pH 9,6 (100 µl mỗi giếng). Kháng nguyên 3ABC được thể hiện và được tinh lọc như chỉ định cho xét nghiệm EITB (thấm chuyển điện tích miễn dịch kết hợp enzyme – enzyme-linked immunoelectrotransfer blot) (45).
   
2. 
   Các phiến này được rửa sáu lần với PBS, pH 7,2, được bổ sung với 0,05% Tween 20 (PBST).
   
3. 
   Huyết thanh xét nghiệm (100 µl mỗi giếng) được thêm vào ở độ pha loãng 1/20 trong kết hợp đệm gồm PBS, 0,05% Tween 20, 5% bột sữa không béo, 10% huyết thanh ngựa và 0,1% chiết xuất (lysate) từ Escherichia coli. Mỗi phiến bao gồm một bộ các đối chứng dương tính mạnh, dương tính yếu và âm tính, đã được hiệu chỉnh theo Tiêu chuẩn Quốc tế về Huyết thanh như mô tả dưới đây.
   
4. 
   Các phiến này được ủ trong 30 phút ở 37^oC và được rửa sáu lần trong PBST.
   
5. 
   Kết hợp IgG của thỏ kháng loài đã kết hợp với peroxidase của cây cải ngựa (horseradish peroxidase) được pha loãng một cách tối ưu trong kết hợp đệm, được thêm vào 100 µl mỗi giếng và được ủ trong 30 phút ở 37^oC.
   
6. 
   Sau sáu lần rửa, từng giếng được đổ đầy bằng 100 µl 3’3’, 5’5’-tetramethylbenzidine cộng với 0,004% (w/v) H₂O₂ trong đệm phosphate/citrate, pH 5,5.
   
7. 
   Phản ứng được làm ngưng sau 15 phút ủ ở nhiệt độ phòng, bằng cách thêm vào 100 µl H₂SO₄ 0,5 M. Hấp phụ được đọc ở 450 nm và ở 620 nm để điều chỉnh nền.
   
8. 
   Diển giải các kết quả: Các kết quả xét nghiệm được thể hiện là tỷ lệ phần trăm dương tính so sánh với đối chứng dương tính [(mật độ quang học của các giếng xét nghiệm hay đối chứng/mật độ quang học của đối chứng dương tính mạnh) x 100] hay cách khác là một xét nghiệm đối với chỉ số đối chứng (test to control – T/C) tương ứng với một ngưỡng đối chứng (tức là ngưỡng dương tính). Cấu hình các cấp độ phản ứng kháng thể đối với protein không cấu trúc trong các đàn theo tuổi/sử dụng vaccin giúp cho diễn giải tình hình bệnh nhiễm của đàn trong các quần thể đã được cấp vaccin (15). Các giá trị ngưỡng của xét nghiệm, có hay không các vùng nghi ngờ, cần được xác định có cân nhắc đến mục đích xét nghiệm và quần thể mục tiêu. Các kết quả không xác định có thể được tiếp theo bằng các xét nghiệm xác nhận. Trong trường hợp thú vật được cấp vaccin nhiều lần (multivaccinated), EITB là tiếp cận khuyên áp dụng, trong khi ở thú vật chỉ được nhận một hay hai lần cấp vaccin, các kết quả không xác định được hóa giải và các kết quả dương tính được xác nhận bằng xét nghiệm lại với một xét nghiệm ELISA lần hai đối với protein không cấu trúc (có tính đến điều kiện phụ thuộc của hai xét nghiệm). Điều này phải tính đến độ nhạy và tính đặc hiệu của tổng thể hệ thống xét nghiệm, khi thiết kế chương trình giám sát huyết thanh học. Mặc dù không là xét nghiệm cần thiết cho giao thương, các ELISA đối với protein không cấu trúc (NSP ELISA) có thể có giá trị bổ sung trong các hoàn cảnh mà không biết được chủng huyết thanh hay phân chủng của virus trong quốc gia.
   

Xét nghiệm EITB đã được áp dụng rộng rãi ở Nam Mỹ như là xét nghiệm xác nhận cho phương pháp theo dõi chỉ số. Thông tin chi tiết hiện có từ Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE, Panaftosa, PAHO/WHO.

1. 
   Có năm protein không cấu trúc (NSPs) của virus FMD được chế tạo nhân tạo (bioengineered) là 3A, 3B, 2C, 3D và 3ABC được biểu thể hiện trong E. coli C600 bằng kích thích nhiệt (thermo-induction). Polypeptide 3D được thể hiện trong dạng hoàn chỉnh (45), trong khi phần còn lại của các proteins thu được từ làm tan chảy đến phần gốc N của gen MS-2 polymerase (60).
   
2. 
   Polymerase đã được thể hiện này được tinh lọc qua phosphocellulose, sau đó bằng các cột poly(U) Sepharose.
   

3. 
   Một hỗn hợp chứa 20 mg/ml của từng polypeptide tái tổ hợp đã được tinh lọc được tách ra trên 12,5% SDS-PAGE và điện di được chuyển đến nitrocellulose (45).
   

1. 
   Số lượng dải xét nghiệm cần thiết phải được xác định trước, tính đến dải xét nghiệm cho từng tấm nitrocellulose, với chất keo điện di đã biết cho mỗi huyết thanh dương tính, huyết thanh dương tính yếu, một ngưỡng và một huyết thanh âm tính đối chứng đã xác định. Thông thường, có 24 dải nitrocellulose, mỗi dải rộng 3 mm cho keo điện di.
   
2. 
   Một thể tích 0,8 ml đệm bão hòa (50 mM Tris/HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 0.2% Tween 20; 5% sữa khô tách béo; và 0.05% chiết xuất (lysate) của E. coli) được đổ vào từng phiến. Các dải tráng kháng nguyên được kết hợp bằng đặt trên các khay trên một giàn giá và lắc rung trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (20-22^oC).
   
3. 
   Một độ pha loãng từ 1/200 của huyết thanh xét nghiệm và của từng đối chứng được cho vào các lỗ tương ứng. Các dải phải được ngập hoàn toàn và úp mặt xuống dưới, và được để ở vị trí này trong suốt quá trình xét nghiệm.
   
4. 
   Các dải này được ủ trong 60 phút trên một giàn giá ở nhiệt độ phòng.
   
5. 
   Dịch lỏng được đổ ra khỏi khay, và từng dải xét nghiệm được rửa ba lần bằng dung dịch rửa (50 mM Tris/HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; và 0.2% Tween 20), bằng cách lắc rung trong 5 phút.
   
6. 
   Dung dịch từ huyết thanh thỏ kháng huyết thanh bò đã kết hợp với phosphatase kiềm, được thêm vào từng giếng xét nghiệm, và các dải này được ủ bằng lắc rung trong 60 phút ở nhiệt độ phòng.
   
7. 
   Chất dịch được đổ ra khỏi khay và từng dải xét nghiệm được rửa ba lần bằng dịch rửa như trên.
   
8. 
   Dung dịch chất nền (0.015% bromochloroindolylphosphate/0.03% nitroblue tetrazolium) được chuẩn bị trong đệm chất nền (100 mM NaCl; 5 mM MgCl₂; and 100 mM Tris/HCl, pH 9.3) và được thêm vào từng giếng xét nghiệm.
   
9. 
   Các dải được ủ bằng cách đặt khay xét nghiệm vào máy trộn quay vòng và lắc đến khi ngưỡng đối chứng thể hiện thành năm dải rõ ràng. Các dải được rửa bằng vòi nước đã khử ion và làm khô trong không khí.
   
10. 
    Diễn dải các kết quả: EITB có thể được quét bằng mật độ kế (densitometer), nhưng việc đọc bằng mắt, dù là ít chính xác hơn, cũng được cho là thích hợp. Từng huyết thanh đối chứng được chạy sao cho thể hiện tối thiểu từng kháng nguyên của năm kháng nguyên. Một mẫu xét nghiệm được coi là dương tính nếu các kháng nguyên 3ABC, 3A, 3B và 3D(±2C) chứng minh mật độ màu tương đương hay cao hơn so với các đối chứng tương ứng. Một mẫu được coi là âm tính nếu hai hay nhiều kháng nguyên chứng minh mật độ thấp hơn huyết thanh đối chứng của nó. Các mẫu xét nghiệm không khớp với cấu hình nào thì được cho là không rõ ràng.
    

Việc lựa chọn các dòng vaccin gần đây mới được xem xét (48). Sử dụng vaccin ngừa một chủng huyết thanh của virus FMD không cho ra bảo hộ chéo đối với các chủng huyết thanh khác, và cũng có thể thất bại trong bảo hộ đầy đủ hay không bảo hộ đối với các dòng khác của cùng một chủng huyết thanh. Phương pháp trực tiếp và tin cậy nhất để đo lường bảo hộ chéo là cấp vaccin cho loài mục tiêu thích hợp và sau đó thử thách chúng bằng tạo phơi nhiễm với dòng virus chống lại bảo hộ. Điều này sẽ tính đến cả mức độ và phản ứng chéo. Tuy nhiên, tiếp cận này là chậm và chi phí cao, và việc sử dụng thú vật cho nghiên cứu này phải hạn chế nếu có thể, bằng cách áp dụng thay thế ở ngoại môi trường.

Có các phương pháp khác nhau ở ngoại môi trường có thể áp dụng được để đo lường các khác biệt kháng nguyên giữa các dòng virus FMD và do đó ước tính khả năng bảo hộ chéo giữa dòng virus vaccin với dòng virus thực địa. Phân loại gen di truyền và cấu hình kháng nguyên cũng có thể bộc lộ việc nổi lên các dòng mới mà nhờ đó so sánh vaccin có thể cần đến, và ngược lại, có thể chỉ ra rằng dòng phân lập là tương đương với dòng phân lập mà thông tin so sánh vaccin là sẵn có.

Việc chọn lựa dòng virus vaccin thích hợp là yếu tố quan trọng trong kiểm soát FMD và là cần thiết cho áp dụng các chương trình sử dụng vaccin trong các khu vực bị ảnh hưởng bởi FMD, cũng như để thiết lập và duy trì các dự trữ gen vaccin sẽ được sử dụng trong trường hợp bị tấn công bởi virus FMD mới.

Hiệu lực của vaccin cũng góp phần cho phổ bao trùm kháng nguyên của một vaccin. Một vaccin có hiệu lực cao là vaccin kích thích ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, có thể cho ra bảo hộ tốt hơn đối với virus tương ứng và tốt hơn so với vaccin cho phản ứng chéo mà chỉ kích thích miễn dịch yếu. Hơn nữa, các liều nhắc lại của vaccin có thể làm gia tăng hiệu quả và sau đó làm gia tăng mức độ rộng phổ kháng nguyên được tạo bởi một vaccin, tuy nhiên, sự xuất hiện của bảo hộ đầy đủ có thể bị trì hoãn.

2. Chọn lựa virus thực địa để so sánh vaccin

So sánh huyết thanh học của các dòng virus thực địa với virus vaccin cần đến những dòng mà đã được xác định chủng huyết thanh và đã thích nghi với các tế bào nuôi cấy. Chủng huyết thanh này thường được xác định bằng ELISA hay CFT sử dụng các tác nhân thử huyết thanh học đặc hiệu với chủng, tuy nhiên, các phương pháp dựa vào các kháng thể đơn giá hay phân chủng di truyền cũng có thể áp dụng. Các tế bào nuôi cấy BHK hay IB-RS-2 thường được sử dụng cho nhân giống virus ở ngoại môi trường. Để so sánh với vaccin một cách thích hợp, ít nhất hai dòng phải được đánh giá từ ổ dịch bất kỳ và các kết quả phải theo xác định có hay không thực sự do các khác biệt kháng nguyên hay là một kết quả ảo của xét nghiệm.

Các virus có thể được chọn lựa dựa vào thông tin dịch tễ học, thí dụ như phân lập từ các giai đoạn khác nhau của ổ dịch, từ các vị trí địa lý khác nhau hay từ các ký chủ khác nhau (4). Bằng chứng thực địa về một nghi ngờ không có tính hiệu quả của vaccin, như thể hiện trở nên giảm bảo hộ, là tiêu chí quan trọng cho so sánh vaccin.

Cấu hình kháng nguyên bởi CFT hay ELISA, hay phân tích kết chuỗi của gen VP1, là các tiếp cận thích hợp cho chọn lựa dòng virus đại diện cho so sánh vaccin. Cấu hình kháng nguyên được thực hiện bằng CFT sử dụng các nhóm huyết thanh siêu miễn dịch của chuột lang kháng các dòng phân lập thực địa có liên quan dịch tễ học (16) hay bằng ELISA sử dụng các nhóm kháng thể đơn giá đã xác định tính đặc trưng (5).

Chủng huyết thanh của virus, vùng nguồn gốc và mọi thông tin về các đặc tính của dòng thực địa có thể cho ra các chỉ thị như đối với các dòng vaccin mà cho ra tính kháng nguyên gần giống nhất. Sự sẵn có của các tác nhân thủ để so sánh đối với từng dòng virus vaccin có thể làm giới hạn khả năng của xét nghiệm. Việc xác định tính kháng nguyên có hai mục đích; thứ nhất là chọn ra dòng virus vaccin hiệu quả nhất để sử dụng trong một hoàn cảnh đặc trưng, và thứ nhì, để theo dõi trên cơ sở thực tế về tính thích hợp của các dòng virus vaccin được duy trì trong chiến lược bảo tồn kháng nguyên.

Mối liên quan huyết thanh học giữa một dòng virus thực địa với virus vaccin (giá trị ‘r’) có thể xác định được bằng CFE, ELISA hay VNT (40, 49, 55). Xét nghiệm một chiều được khuyến cáo (r₁ – recommended) với một kháng huyết thanh của vaccin, hơn là xét nghiệm hai chiều (r₂) mà cũng cần một kháng huyết thanh kháng với dòng thực địa sẽ được so sánh. Do bản chất về khả năng lặp lại thấp của xét nghiệm áp dụng, các xét nghiệm lặp lại cần phải có kết quả tin cậy (56). Quá trình trung hòa ở ngoại môi trường có thể có liên quan nhiều hơn đến bảo hộ ở nội môi trường, hơn là liên quan đến các số đo khác về tương tác virus-kháng thể, tuy nhiên các kháng thể không trung hòa cũng có thể có bảo hộ (43). Các lợi thế của ELISA là xét nghiệm nhanh chóng và sử dụng ít thể tích huyết thanh sau cấp vaccin, mà huyết thanh thì thường có giới hạn số lượng. ELISA và CFT được khuyên áp dụng làm các phương pháp theo dõi, trong khi phương pháp VNT hay phương pháp tính tỷ lệ bảo hộ (expected percentage of protection – EPP) cho ra các kết quả xác định hơn. Với cả VNT lẫn ELISA, huyết thanh sau cấp vaccin phải được lấy từ ít nhất năm con bò từ 21-30 ngày sau khi có miễn dịch. Hiệu giá kháng thể đối với dòng virus vaccin được thiết lập cho từng huyết thanh. Huyết thanh được sử dụng riêng rẽ theo từng cá thể hay gộp chung, sau khi loại trừ các con thú đáp ứng thấp. Phương pháp CFT sử dụng huyết thanh chuột lang sinh ra kháng với dòng virus vaccin.

Một đánh giá thấu suốt hơn được cho ra bởi phương pháp EPP (4), đo lường khả năng phản ứng của một nhóm kháng huyết thanh sau khi cấp vaccin, sử dụng cả VNT hay ELISA và liên hệ các hiệu giá kháng thể với bảo hộ kháng dòng virus vaccin tương ứng. Những bảng tương quan rút ra từ các xét nghiệm có trước trong thực hiện thử thách tính đặc hiệu của vaccin. Tuy nhiên, yêu cầu dữ liệu cho một nhóm kháng huyết thanh và thử thách kèm theo cho vaccin cần đánh giá, thì hiện nay không thể đáp ứng được theo chủng loại rộng rãi của các dòng virus vaccin.

a) So sánh vaccin bằng ELISA

Xét nghiệm này sử dụng một kháng huyết thanh sinh ra kháng một dòng virus vaccin. Các hiệu giá của ELISA kết khối (blocking ELISA) của huyết thanh tham chiếu này kháng với các kháng nguyên được chuẩn bị từ một dòng virus vaccin tương ứng và được so sánh với các hiệu giá tương ứng của huyết thanh kháng với dòng virus thực địa, để xác định tính kháng nguyên của virus vaccin “giống” đến mức nào với virus thực địa.

Phương pháp xét nghiệm là tương tự như ELISA kết khối thể lỏng (liquid phase blocking ELISA) (xem Đoạn B.2.c). Các tác nhân thử thêm vào là: huyết thanh bò 21-30 ngày sau khi cấp vaccin (làm bất hoạt ở 56^oC trong 45-60 phút); dòng virus vaccin tương đồng; và virus đem xét nghiệm, một dòng phân lập thực địa có cùng chủng huyết thanh như dòng virus vaccin.

• Phương pháp xét nghiệm

1. 
   Nuôi cấy dòng virus thực địa và dòng virus vaccin trong các tế bào BHK hay IB-RS-2. Số lần cấy truyền qua tế bào nuôi cấy phải thấp nhất (bình thường không quá bốn lần) để tránh chọn phải các biến thể kháng nguyên không đại diện cho dòng virus trong chất liệu gốc. Một lượng đủ virus phải hiện diện trong các tế bào nuôi cấy, thể hiện tác động gây bệnh tích tế bào trong vòng 24 giờ nuôi cấy.
   
2. 
   Thu hoạch và chuẩn độ các virus thực địa và vaccin, sử dụng một nhóm kháng huyết thanh bắt giữ của thỏ và kháng huyết thanh dùng phát hiện của chuột lang được sinh ra để kháng với cùng dòng hay các dòng virus vaccin có liên quan trực tiếp với dòng virus vaccin. Nếu cần, các kháng nguyên virus có thể được làm bất hoạt trước bằng sử dụng binary ethyleneimine.
   
3. 
   Chọn lựa kết hợp tối ưu kết hợp cho yếu tố bắt giữ/yếu tố phát hiện (traper/detector) và độ pha loãng của virus thực địa. Độ pha loãng này không dưới 1/6. Nếu không có kết hợp yếu tố bắt giữ/yêu tố phát hiện thích hợp, thì phải thực hiện chuẩn độ ngược lại cho kháng nguyên gốc để xác nhận rằng đủ virus hiện diện. Nếu ở đây xác nhận thấy virus thực địa hiện diện với hiệu giá cao, thì điều này cho thấy không có dòng virus vaccin nào hiện tại là thích hợp.
   
4. 
   Chuẩn độ huyết thanh vào 21-30 ngày sau khi cấp vaccin của một dòng virus vaccin chọn ra, có kháng với dòng virus thực địa và dòng virus vaccin tương ứng. Hiệu giá kháng với dòng virus vaccin sẽ không dao động quá gấp hai lần kể cả hai chỉ số của giá trị cao thấp cho dòng virus gốc.
   
5. 
   Để xác định hiệu giá huyết thanh, tính toán mật độ quang học trung bình (optical density – OD) của 24 giếng kháng nguyên đối chứng không có huyết thanh kết hợp. Hiệu giá này đại diện cho giá trị OD tối đa đối với xét nghiệm, tức là giá trị đối chứng 100%. Chia đôi giá trị này để xác định giá trị ức chế 50%. Ghi điểm các giếng là kết hợp huyết thanh dương tính, nếu OD là thấp hơn hay bằng 50%, và âm tính nếu giá trị OD lớn hơn. Điểm ngưỡng được xác định là độ pha loãng mà ở đó một nửa hay nhiều hơn các giếng thể hiện 50% ức chế (tức là xác định độ pha loãng mà từ giếng đó pha tiếp mà có giá trị OD thấp hơn 50% của kháng nguyên đối chứng). Nếu điểm ngưỡng nằm giữa hai độ pha loãng, điểm ngưỡng được tính là điểm giữa hai độ pha loãng này và được ước tính bằng phương pháp Spearman–Kärber.
   

r₁ = mẫu số hiệu giá của huyết thanh kháng viurs thực địa

mẫu số hiệu giá của huyết thanh kháng virus vaccin

Ít nhất hai kết quả cần có cho chấp nhận được

6. 
   Giải thích các kết quả: với giá trị r₁ rút ra từ ELISA, hướng dẫn sau đây được áp dụng cho giải thích (29):
   

0,2 – 0,39: Dòng virus thực địa có liên quan kháng nguyên với dòng virus vaccin. Dòng virus vaccin này sẽ thích hợp cho sử dụng khi không có tương quan gần, với điều kiện là vaccin sử dụng một cách hiệu quả và thú vật được cấp vaccin nhiều hơn một lần.

Xét nghiệm này cũng sử dụng một kháng huyết thanh sinh ra để kháng với dòng virus vaccin. Các hiệu giá của huyết thanh này đối với 100 TCID₅₀ của dòng virus vaccin tương ứng và đối với cùng liều lượng của dòng virus thực địa, được đem so sánh để xác định tính kháng nguyên “giống nhau” như thế nào giữa virus vaccin và virus thực địa.

Phương pháp thực hiện giống như xét nghiệm trung hòa virus trên phiến vi hiệu giá (xem Đoạn B.2.a). Ngoài ra các tác nhân thử là: huyết thanh bò 21-30 ngày sau khi cấp vaccin (được làm bất hoạt ở 56^oC trong 45-60 phút); dòng vaccin virus tương ứng; virus đem xét nghiệm, là dòng virus thực địa mà có cùng chủng huyết thanh với dòng virus vaccin.

1. 
   Dòng virus thực địa được cấy truyền trên các tế bào nuôi cấy cho đến khi thích ứng để cho ra 100% CPE trong 24 giờ. Số lần cầy truyền phải giữ tối thiểu. Khi đã thích ứng, xác định hiệu giá virus (log₁₀ TCID₅₀/ml) bằng chuẩn độ đến ngưỡng (end-point titration).
   
2. 
   Với từng virus xét nghiệm và virus vaccin, thực hiện một bảng ghi chép hiệu giá của huyết thanh vaccin kháng virus theo độ pha loãng của virus. Các tế bào được đưa vào và ủ ở 37^oC trong 48-72 giờ sau đó đánh giá tác động gây bệnh tích tế bào.
   
3. 
   Các hiệu giá kháng thể của huyết thanh vaccin kháng với dòng virus vaccin và virus thực địa theo từng liều lượng virus được sử dụng để tính toán bằng cách áp dụng phương pháp Spearman-Kärber. Hiệu giá của huyết thanh vaccin kháng 100 TCID₅₀ của từng virus sau đó có thể ước tính bằng hồi quy. Mối liên quan giữa virus vaccin và virus thực địa được biểu diễn bằng giá trị ‘r’ như đã mô tả đối với so sánh vaccin bằng ELISA.
   
4. 
   Giải thích các kết quả: trong trường hợp trung hòa, giá trị r₁ lớn hơn 0,3 cho thấy dòng virus thực địa đủ tương đồng với dòng virus vaccin sử dụng trong vaccin, có thể cho ra bảo hộ đối với thử thách bằng virus thực địa (54). Ngược lại, các giá trị thấp hơn 0,3 chỉ ra rằng virus thực địa khác biệt với virus vaccin, thì vaccin này có thể không cho bảo hộ. Trong những trường hợp này, không những dòng virus thực địa phải được kiểm tra theo các dòng virus vaccin khác, mà còn phải tạo thích nghi cho dòng virus thực địa trở thành một dòng vaccin mới.
   
5. 
   Các xét nghiệm luôn được lặp lại nhiều hơn một lần. Độ tin cậy với các giá trị ‘r’ sẽ có thể dùng để chỉ ra khác biệt giữa các dòng virus là liên quan đến số lần mà xét nghiệm lặp lại. Trên thực tế, khuyên rằng lặp lại xét nghiệm ít nhất ba lần.