TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN    nguyễn thị ngọc tú phân tích đỘt biến gen tarn và nd3 CỦa adn ty thể Ở BỆnh nhân ung thư ĐẠi trực tràNG

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

tải về 0.65 Mb.

trang	5/8
Chuyển đổi dữ liệu	30.08.2016
Kích	0.65 Mb.
	#28456

1 2 3 4 5 6 7 8

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được lấy tại vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5-10 cm). Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này gồm 61 mẫu do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp – Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội cung cấp trong thời gian từ tháng 8 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012. Mẫu sử dụng đã được thống kê ở bảng 3. Mẫu mô được đựng trong ống eppendorf, vận chuyển từ bệnh viện về trong nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu âm 80C cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng

Bệnh viện cung cấp mẫu	Số mẫu	Ung thư đại tràng	Ung thư trực tràng	Ung thư giữa đại và trực tràng
K2 Tam Hiệp	31	12	17	2
Việt Đức	30	18	12	0

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 4.

Bảng 4. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất	Hãng cung cấp	Mục đích
QIA amp DNA minikit	QIAGEN (Đức)	Tách ADN tổng số
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN (Đức)	Tinh sạch ADN
Agarose	Invitrogen (Mỹ)	Điện di
SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide	Pharmacia (Thụy Điển)	Điện di
Các cặp mồi 10398, 3243	IDT (Mỹ)	PCR
Master Mix 2X	NEB (Mỹ)	PCR
Enzyme Fastdigest® HaeIII Enzyme Fastdigest®DdeI	Fermentas (Đức)	RFLP

Các hóa chất khác như: acid boric, Tris – base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat, bạc nitrat… được sử dụng đều có độ sạch phân tích.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cộng nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên được sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong bảng 5.

Bảng 5. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

STT	Tên thiết bị	Hãng sản xuất
1	Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700)	Applied BioSciences (Mỹ)
2	Nguồn điện di PowerPac™ HC	Bio–rad (Mỹ)
3	Bể điện di Mini–Sub Cell GT, MiniProtean 3 cell	Bio–rad (Mỹ)
3	Máy ly tâm lạnh 5417R	Eppendorf (Đức)
4	Tủ lạnh – 20C và – 80C	Nuaire (Mỹ)
5	Bể ổn nhiệt ED5	Julabo (Đức)
6	Tủ an toàn sinh học	Nuaire (Mỹ)
7	Máy làm khô chân không (Speed Vac)	Thermo Electron (Mỹ)

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lò vi sóng…

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành phân tích đột biến A3243G và A10398G, chúng tôi thực hiện phương pháp PCR-RFLP. Trước hết ADN tổng số được tách chiết từ mô u và mô lân cận u. Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sự có mặt của đoạn gen chứa đột biến này được kiểm tra bằng phương pháp điện di. Bước tiếp theo chúng tôi thực hiện cắt đoạn gen này bằng enzym giới hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di. Để khẳng định kết quả, đoạn gen chứa đột biến được tinh sạch và được gửi đi giải trình tự.

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân được lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô được cân với lượng tương đương 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô được thủy phân hoàn toàn.
Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.
Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.
Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bước này thêm 1 phút nếu chưa hết dịch trên cột.
Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl buffer AE hoặc nước sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bước trên 2 lần.
Làm khô dịch thu được bằng máy Speed vac trong 2h.
Hòa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.

2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (10¹²–10¹³ bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).

Các cặp mồi được chúng tôi thiết kế bằng chương trình Primer premier 5. Trình tự các cặp mồi được trình bày ở bảng 6.

Bảng 6. Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi	Trình tự mồi		Kích thước sản phẩm (bp)
10398	f	5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’	246
	r	5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’
3243	f	5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’	218
	r	5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

PCR được thực hiện với các thành phần của phản ứng như trong bảng 7.

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l

Thành phần	Thể tích (l)	Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x	6,25	1X
Primer F 10µM	0,25	0,2 M
Primer R 10µM	0,25	0,2 M
ADN khuôn	2
Nước	3,75

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 như sau:

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 3243 như sau:

2.2.3. Phân tích RFLP

Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.

+ Với đoạn gen 10398 ADN ty thể: sử dụng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme này có vị trí nhận biết trên ADN như sau:

5’…C/TNAG…3’

3’…GANT/C…5’

Phân tích vị trí nhận biết các enzyme giới hạn trên đoạn gen 246 bp và nhận thấy trong trường hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoạn gen ở một vị trí và tạo thành các đoạn oligonucleotide có kích thước 50 bp và 196 bp.

Trong trường hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoạn gen ở 2 vị trí và kết quả cắt enzyme thu được các đoạn oligonucleotide có kích thước 38 bp, 50 bp và 158 bp.

+ Với đoạn gen 3243 ADN ty thể: sử dụng enzyme cắt FastDigest® HaeIII nhận biết vị trí cắt trên ADN tại trình tự:

5’…GG/CC…3’

3’…CC/GG…5’

Đoạn gen 3243 được nhân lên có kích thước 218 bp. Trong trường hợp không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoạn gen này tại hai vị trí, dẫn tới sản phẩm thu được là các đoạn có kích thước 22 bp, 27 bp và 169 bp.

Trong trường hợp có đột biến 3243G thì vị trí này sẽ trở thành vị trí cắt của HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiện các đoạn có kích thước 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.

Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI được mô tả trong bảng 8.

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Thành phần	Thể tích
10X FastDigest® buffer	2µl
Sản phẩm PCR (~0.2 µg)	10µl
FastDigest® enzyme	1µl
Nước	Bổ sung đến đủ 30 µl

Thành phần phản ứng sau khi được trộn đều thì tiến hành ủ ở 37 ⁰C theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp được trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút trong bể ổn nhiệt ở 37⁰C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn

Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt như protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hướng tới cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.

2.2.4.1. Điện di gel agarose

Điện di gel agarose được thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel được trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6]

Nồng độ gel (%w/v)	Dãy kích thước tách hiệu quả (kb)
0,5	2–25
0,7	0,8–10
1,2	0,4–5
1,5	0,2–3
2,0	0,1–2
2,5	0,05–1,5

Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di được thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (UV).

Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR

Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)
Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).
Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lược để tạo giếng.
Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20–30 phút).
Sản phẩm PCR được trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.
Bản gel sau điện di được nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia tử ngoại (UV).

2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide được tổng hợp ngay trước khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis–acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lưới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tương tự, tùy hàm lượng của bis–acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thước và điện tích của ADN.

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6]

Nồng độ gel (%w/v)	Giới hạn phân tách với ADN (bp)
5	80500
8	60400
12	50300
15	40200
20	5100

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm

Thành phần	Thể tích
Monoacrylamide 30%	1,33 ml
TBE 1X	3,67 ml
APS 10%	37,5 l
TEMED	3 l

Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di được nhuộm bạc theo phương pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bước sau:

Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.
Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.
Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO₃; 0,056% formaldehyde) trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.
Rửa nước khoảng 30 giây–1 phút.
Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na₂CO₃, 0,056% formaldehyde, 400 µg/l natri thiosulfate Na₂S₂O₃) trong 3–5 phút.
Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.
Bảo quản gel bằng nước cất.
Quan sát kết quả dưới ánh sáng trắng.

2.2.5. Tinh sạch ADN

Đoạn gen chứa đột biến A10398G được khuếch đại bằng phản ứng PCR và được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN (Đức). Quy trình tinh sạch được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Đoạn gen chứa đột biến A10398G sau khi được khuếch đại bằng PCR, được điện di trên gel agarose 1%.
Cắt các mảnh gel agarose chứa ADN, cho các mảnh này vào ống sạch
Bổ sung 3 thể tích đệm QG cho một thể tích gel (100mg ≈ 100µl).
Ủ ở 50^oC trong 10 phút (hoặc cho đến khi miếng gel đã hòa tan hoàn toàn). Trong thời gian ủ, cứ 3 phút lại vortex ống.
Sau khi gel đã hòa tan hoàn toàn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có màu vàng là được. Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc tím thì thêm 10 µl Natri acetat 3M, pH 5,0 vào hỗn hợp và mix.
Thêm một thể tích isopropanol vào mẫu và mix
Đưa mẫu lên cột, ly tâm 1 phút, tốc độ 13000 rpm, nhiệt độ phòng.
Đổ bỏ phần dịch qua cột, thêm 0,5 ml đệm QG lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút
Để rửa, bổ sung 0,75 ml đệm PE lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút
Đổ bỏ phần dịch qua cột, ly tâm cột thêm một phút ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm.
Để thôi ADN: thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.
Tiếp tục thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.
Speed vac ống đến thể tích 20 µl, điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%.

ADN sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự.

2.2.6. Tính toán thống kê

Xử lý các số liệu phân tích theo các phương pháp thống kê thường dùng. So sánh các đặc trưng thống kê mẫu bằng phép kiểm định 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 0.65 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6 7 8