TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN nguyễn thị ngọc tú phân tích đỘt biến gen tarn và nd3 CỦa adn ty thể Ở BỆnh nhân ung thư ĐẠi trực tràNG
tải về 0.65 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- DANH MỤC CÁC HÌNH
- MỞ ĐẦU
- Chương 1- TỔNG QUAN
- 1.1.1. Hệ genome ty thể
- 1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể
- 1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư
DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29] 13 Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau [29] 15 Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng 26 Bảng 4. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 26 Bảng 5. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 27 Bảng 6. Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 29 Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l 29 Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI 31 Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] 32 Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] 33 Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm 34 Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng 44 DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]. 4 Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] 6 Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19] 9 Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76]. 11 Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77]. 15 Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]. 17 Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô 37 Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 38 Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII. 39 Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398 40 Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI 41 Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G 42 Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể 43 Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G 43 Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể 44 Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô 46 Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính 48 Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi 49 Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u. 49 Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u 50 Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch. 51 Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM 52 Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa 53
MỞ ĐẦUTy thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn. Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành năng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể còn đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis (quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. Cho đến nay, người ta đã thống kê được trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng, chúng có thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến do thay đổi các nucleotide [57]. Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học. Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thư – đề tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới. Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày. Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể, đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng” với mục đích:
Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chương 1- TỔNG QUAN1.1. TY THỂTy thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh dưỡng thành năng lượng trong ATP. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn. Ty thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặt tên là mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường có dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường [3]. Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào vì là nơi chuyển hóa các chất hữu cơ thành năng lượng tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa như: Apoptosis (quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. 1.1.1. Hệ genome ty thểTy thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa. Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã của ty thể [10] (hình 1). Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của tế bào chất. Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60]. Hệ gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi polypeptide được mã hóa trong ty thể [41]. 
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]. Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau. Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngưỡng đột biến [51]. Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể. 1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thểNhững đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ đầu những năm 1980, và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã được tìm thấy [68]. Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các hư hại trong quá trình tạo ATP. Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu cầu tối thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein tham gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa. Số lượng các phân tử ADN ở các mô, các cơ quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh hưởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ xương, tim, thận, gan, tụy. Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ [57]. Tuy nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan đến đột biến gen phổ biến ở người, ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong quần cư dân [22] (hình 2). 
Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người được phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và ngoại biên. Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]: Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A, G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác chung giảm kèm chứng loạn màu sắc. Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V. Người bệnh có biểu hiện chậm phát triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh. Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6, giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hội chứng Leigh. Người bệnh có biểu hiện rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu hiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thương ở một hoặc nhiều khu vực của hệ thần kinh trung ương. Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ (MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu). Bệnh có các triệu chứng rối loạn thần kinh trung ương, liệt nửa người, mù và nôn mửa. Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra bởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys). Người bệnh có biểu hiện tai biến, co giật cơ, lưỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhược thần kinh do teo não, nhược cơ. 1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thưMối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thư đã được Otto Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 1930, khi ông giả thiết rằng sự tăng tốc độ của quá trình đường phân hiếu khí trong nhiều loại mô u là do sự hư hại chuỗi hô hấp trong những tế bào này [70]. Theo Warburg, một số biến đổi của ty thể có liên quan đến ung thư là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp. Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS). Trong điều kiện các electron bị thừa quá mức (ví dụ như khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ enzym chuỗi hô hấp, các ROS được tạo ra rất nhiều. Sự tăng của ROS, hoặc stress oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hư hại các thành phần lipid và protein nội bào. Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS, làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào. Như vậy biến đổi của hệ gen ty thể có liên quan đến bệnh ung thư [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã được xác định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi ADN ty thể đã được xác định trong ung thư. Các biến đổi này bao gồm: đột biến điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể. 
Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19] Đột biến điểm Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú, Tan và cs (2002) đã giải trình tự genome ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của cùng bệnh nhân và đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) được xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và ATPase 6 [58]. Trong số các đột biến trên, đột biến thêm hoặc mất base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng ghi mã và không ghi mã [55]. Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng. Polyak và cs đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S và 16S [53]. Với bệnh ung thư buồng trứng, Liu và cs đã xác định được 60% đột biến ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột biến điểm T→C hoặc G→A. Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA, 16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả năng bị đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng [45]. Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày, Wu và cs đã xác định được 48% mang đột biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất base tại vị trí nucleotide 303-309 (vị trí D310) [72].
ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, như mất đoạn 4977 bp, đã được xác định ở ung thư vú [14], ung thư đại trực tràng [21]. Trong một nghiên cứu khác, Burgart và cs đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%) bệnh nhân ung thư dạ dày [17]. Thêm đoạn Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp) trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ dày [72]. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau. Thay đổi số bản sao ADN ty thể Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thư. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung thư đại trực tràng [44]. Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác định thấy ở bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng trứng [69]. Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư. Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. Mặt khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty thể [38].
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.65 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|