TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN nguyễn thị ngọc tú phân tích đỘt biến gen tarn và nd3 CỦa adn ty thể Ở BỆnh nhân ung thư ĐẠi trực tràNG
ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
tải về 0.65 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể
- 1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể
- 1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh
- 1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNGHiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã hóa và vùng không mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Năm 1998, Polyak và cs đã xác định được đột biến ADN ty thể ở các vùng mã hóa: ND1, ND4L, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S và 16S [53]. Trong một nghiên cứu khác, Mansoureh và cs khi phân tích cặp mô thường và mô bệnh của 30 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, đã phát hiện 15 mẫu mang đột biến trên vùng ND1, trong đó có 7 đột biến khác nhau. Đột biến T4216C chiếm 27%, khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thường và mô bệnh [49]. Alonso và cs (1997) xác định sự có mặt của đột biến ADN ty thể (23%) trên vùng D-Loop. Những đột biến này là đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp, và đột biến thêm 2 bp [9]. Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thấy rằng 88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) hoặc giữa các pyrimidine (C, T), 11,4% còn lại là đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một purin với một pyrimidine). Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA. 60% đột biến nằm trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này làm thay đổi acid amin [56]. Trong luận văn này chúng tôi muốn đi sâu vào đột biến ADN ty thể trên gen tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) và gen ND3 (tại vị trí A10398G).
1.3.1.1. Đột biến A3243G và các bệnh liên quan Đột biến A3243G trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR) đã được phát hiện ra đầu tiên như là một nguyên nhân di truyền của bệnh MELAS [31]. Đột biến A3243G liên quan tới MELAS là một trong số những đột biến gây bệnh phổ biến nhất của ty thể với tần số được xác định trong khoảng từ 0,95- 18,4/100000 dân số Bắc Âu [22]. Đột biến điểm mtDNA A3243G được gây ra bởi sự thay thế Adenine ở vị trí 3243 thành Guanine trên gen mã hóa cho tRNALeu (UUR) của ADN ty thể. Đột biến này làm thay đổi nucleotide của bộ ba đối mã dẫn đến ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein ty thể và giảm hoạt động của các phức hệ của chuỗi hô hấp [28]. Cũng giống như nhiều đột biến ảnh hưởng tới chuỗi hô hấp, đột biến A3243G không chỉ có ảnh hưởng tới bệnh MELAS, nó còn ảnh hưởng tới một số bệnh khác, gồm CPEO và DMDF (đái tháo đường và điếc)…[36]. Đột biến này thường ở dạng không đồng nhất (heteroplasmic), có nghĩa là ADN dạng dại và dạng đột biến cùng tồn tại trong một tế bào. Các biểu hiện lâm sàng của bệnh xuất hiện khi các phân tử ADN mang đột biến đạt đến một tỷ lệ nhất định. Tỷ lệ này ở các mô và các bệnh khác nhau là khác nhau. Wallace và cs (2002) đã xác định được tỷ lệ không đồng nhất ở trong máu bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường do bị đột biến A3243G ADN ty thể là 10%, trong khi đó tỷ lệ này trong mô cơ hoặc não ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS có thể tới 70% [67]. 1.3.1.2. Đột biến A3243 và bệnh ung thư đại trực tràng Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh cơ thần kinh, tiểu đường. Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G trên bệnh nhân ung thư trực tràng. Lorenc và cs (năm 2003) khi nghiên cứu các đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung thư, đã phát hiện một mẫu ung thư trực tràng có đột biến A3243G dạng đồng nhất (homoplasmic) [46]. 1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thểCũng giống như genome nhân, hệ gen ty thể mang những trình tự đa hình. Đa hình là sự khác biệt về chuỗi ADN giữa những cá thể, các nhóm, hoặc các quần thể. Nó bao gồm đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism - SNP), các chuỗi lặp, thêm đoạn, mất đoạn và tái tổ hợp. Đa hình gen có thể là kết quả của sự thay đổi quá trình, hoặc được tạo nên bởi yếu tố bên ngoài (như virus hoặc chiếu xạ) [35]. Người ta cho rằng đa hình giúp ty thể ít nhạy cảm hơn với sự thay đổi năng lượng, do đó tạo nhiều nhiệt và các gốc tự do, giúp con người thích ứng khi di cư tới nơi có khí hậu lạnh hơn, như từ châu Phi sang châu Âu [52]. Ngày nay, số lượng đa hình được biết đến đã vượt quá 1000 [22]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy đa hình ở ty thể có liên quan đến một số bệnh như: đái đường [34] , bệnh Parkinson [22], Alzheimer [24], và một số bệnh ung thư như ung thư vú [18], ung thư tuyến tiền liệt [16], ung thư đại trực tràng [40], ung thư phổi [23]… 1.3.2.1. Đa hình A10398G và các bệnh Vị trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong hệ genom ty thể người có tính đa hình cao. Đa hình này làm biến đổi Threonine (alen A) thành Alanine (alen G) ở đầu C của dưới đơn vị ND3 của phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đa hình 10398A tăng trong các bệnh thoái hóa thần kinh tuổi già như bệnh Parkinson [66], Alzheimer [65], và bệnh teo cơ xơ cứng [48]. Ngoài ra trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc đã cho thấy alen G trong thay thế 10398AG làm tăng nguy cơ gây hội chứng chuyển hóa [34]. A10398G là một trong những SNP thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học bởi nó có liên quan với việc tạo thành những khối u. Canter và cs (2005) lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình 10398A với bệnh ung thư vú trên những người phụ nữ Mỹ gốc Phi, nhưng không thấy mối liên hệ nào ở người Mỹ da trắng. Các tác giả cho rằng sự tương tác giữa các yếu tố gen và môi trường có thể gây ra sự khác nhau giữa các tộc người [18]. Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối tượng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trò của đa hình 10398A đối với sự phát triển của ung thư vú [55]. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã giải thích sự khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện trong các khu vực địa lý khác nhau. Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 người phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú và 260 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thư vú [12]. Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển ung thư vú trên đối tượng là người Ba Lan [25]. Khi nghiên cứu trên đối tượng là người Mỹ gốc Phi mắc ung thư tiền liệt tuyến, người ta thấy rằng 10398G làm tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh. Trong một nghiên cứu khác, 10398G được tìm thấy ở bệnh ung thư tuyến giáp [74]. Nghiên cứu của Choi và cs (2011) đã xác định vị trí 10398 trên gen ND3 là điểm nóng gây đột biến ở bệnh ung thư phổi [23]. Theo trình tự ADN ty thể sửa lại của Cambridge, base kiểu dại là A, tuy vậy ở nhiều quần thể G lại là kiểu dại [11]. Kết quả của các nghiên cứu về đa hình A10398G còn nhiều trái ngược và chưa kết luận được alen nào có liên quan đến bệnh lý. Để giải thích cho những kết quả dường như trái ngược này, Fang và cs (2010) cho rằng sự kết hợp giữa đa hình nucleotide đơn của ADN ty thể với các yếu tố khác được mã hóa bởi nhân có thể đóng vai trò trong việc hình thành khối u. Kết quả tiếp theo có thể là sự thay đổi của tín hiệu calci hoặc tín hiệu khử [30]. Ngoài ra, theo một số nhà nghiên cứu, sự tăng của ROS là một cơ chế mà nhờ đó các SNPs ty thể tham gia vào quá trình phát triển khối u. Nó có thể hoạt hóa con đường hình thành ung thư, hoặc có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis (chết theo chương trình) vốn đóng vai trò bảo vệ trong giai đoạn cuối của ung thư. Kết quả của sự biến đổi A→G ở vị trí 10398 dẫn tới sự thay thế threonine bằng alanine ở vị trí 114 thuộc dưới đơn vị ND3 của phức hệ I. Phức hệ này có tham gia vào quá trình tạo gốc tự do trong ty thể, cung cấp electron cho oxy, tạo thành superoxide anion O2-. Sự biến đổi của gen ND3 thuộc phức hệ I có thể đã làm tăng sự thoát ra của electron và sự tạo thành ROS. Để hiểu hơn về vai trò của alen A và G trong đa hình A10398G, nhóm nghiên cứu của Kazuno (2006) đã xác định sự ảnh hưởng của đa hình ADN ty thể tới giá trị pH của chất nền và sự biến đổi của calci nội bào. Kết quả nghiên cứu cho thấy cybrid mang đa hình 10398A có pH chất nền ty thể thấp hơn cybrid mang 10398G. Ngoài ra, 10398A cybrid có nồng độ calci tăng và có thể đạt mức calci cao hơn khi bị kích thích bởi histamine so với 10398G [37]. Ngoài ra, threonine có thể tạo liên kết hidro liên kết chéo giữa các chuỗi protein và dễ dàng chịu sự biến đổi sau dịch mã. Trong khi đó, nguyên tử carbon ở vị trí α của alanine liên kết với nhóm methyl. Nhóm methyl này không hoạt hóa và gần như không tham gia trực tiếp vào chức năng của protein. Tuy vậy, sự thay thế của các acid amin này vẫn chưa được nghiên cứu ở mức độ hóa sinh in vivo. 1.3.2.2. Đa hình ADN ty thể với ung thư đại trực tràng Nghiên cứu về SNPs trên bệnh ung thư đại trực tràng đã được Lascorz và cs (2012) thực hiện trên 613 bệnh nhân ở khu vực miền bắc nước Đức [40]. Kết quả cho thấy có hai SNPs thuộc vùng UQCRB (phức hệ III)là rs7836698 và rs10504961 có liên quan với khả năng sống sót. Ba SNPs có liên quan với sự tiến triển của bệnh ung thư đại trực tràng, trong đó hai SNPs thuộc gen COX6B1 (phức hệ IV) là rs6510502 và rs10420252 có liên quan tới sự xuất hiện của hạch lympho, rs6510502 còn liên quan tới di căn xa. Đa hình rs7971637 trên gen GAPDH có liên quan tới khối u giai đoạn T3/T4. Nghiên cứu về đa hình của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên quần thể người Anh và Scotland cho thấy có 132 SNPs ở quần thể người Anh và 140 SNPs ở quần thể người Scotland [61, 71]. Ở quần thể người Scotland, alen G xuất hiện cao hơn ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở vị trí 750, 1438 (trên gen 12 rRNA), 4769 (trên gen ND2). Ở quần thể người Anh không quan sát thấy mối quan hệ này. Cho đến nay, trên thế giới có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình A10398G với bệnh ung thư đại trực tràng. Fang và cs (2010) khi nghiên cứu các đa hình đặc trưng của các nhóm đơn bội (haplogroups) trên 108 bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú, đại trực tràng và tuyến giáp ở khu vực miền Nam Trung Quốc đã tìm thấy mối liên quan giữa các bệnh nhân thuộc nhóm M với tăng nguy cơ mắc ung thư vú, thuộc nhóm D4a với tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp. Tuy nhiên, các tác giả không phát hiện được mối liên quan nào giữa nhóm đơn bội ADN ty thể, trong đó có đa hình A10398G thuộc nhóm N với sự tiến triển của bệnh ung thư đại trực tràng [30]. Mối liên quan giữa nhóm đơn bội trong quần thể người Anh và Scotland với bệnh ung thư đại trực tràng cũng được phân tích ở các nghiên cứu [61, 71], tuy vậy không phát hiện được sự khác biệt nào có ý nghĩa thống kê.
Phương pháp cơ bản và được sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm của ADN ty thể là PCR-RFLP. Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP). Đầu tiên, đoạn ADN ty thể có chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó được cắt bởi enzym giới hạn thích hợp. Cuối cùng, các đột biến sẽ được nhận biết qua phổ băng điện di. Phương pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận lợi, nhanh chóng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền. Phương pháp giải trình tự Để khẳng định chính xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotide đoạn ADN mang đột biến. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy). Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi. Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN. Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Người ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao. Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Ngoài ra, tỷ lệ không đồng nhất mà phương pháp này có thể xác định được khoảng 25% trở lên. Với mục tiêu phát hiện sớm bệnh ở giai đoạn đầu để điều trị, người ta sử dụng một số phương pháp có khả năng phát hiện mức độ không đồng nhất của ADN ty thể ở một tỷ lệ rất thấp mà phương pháp PCR-RFLP không phân tích được. Đó là phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR) và sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC).
Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang. PCR định lượng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai loại phương pháp phân tích hay được sử dụng:
Phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột biến ADN ty thể với mức độ không đồng nhất thấp dưới 1% [73]. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC) Phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ưu. Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường [43]. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột biến. Để định lượng mức độ không đồng nhất của ty thể, người ta đã xác định mối quan hệ giữa diện tích của đỉnh sắc ký có dị sợi kép và mức độ không đồng nhất của ty thể. Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến ADN ty thể thấp tới 1% [43]. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nướcCho đến nay các nghiên cứu về đột biến ADN ty thể ở người Việt Nam vẫn chưa nhiều, số liệu còn hạn chế và chưa có tính hệ thống. Phan Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam đã tìm thấy một số biến đổi của ADN ty thể ở người Việt Nam thuộc vùng D-loop, các gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8. Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm thấy đột biến A3243G ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến) [2]. Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải trình tự ADN và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnh nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS [4]. Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12 ca có đột biến ADN ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8]. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phương pháp giải trình tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop ở một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa [5]. Liên quan đến xác định đột biến ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam, kết quả thu được còn rất ít. Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú [1]. Nghiên cứu được thực hiện với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân). Kết quả phân tích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop của bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam. Như vậy, như đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã cho thấy đột biến ADN ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty thể và bệnh ung thư. Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm, càng tốt. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu những biến đổi của các gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng với mục đích tìm ra mối liên quan giữa những biến đổi này với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, từ đó giúp cho việc việc chẩn đoán sớm và theo dõi sau điều trị của bệnh ung thư đại trực tràng được tốt hơn. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.65 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
