TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêNM (+) K106 K105 K104 K103 K102 K10 K5 K2 K1 T104 103 T102 T10 T1
Kết quả hình 3.11 cho thấy ở tất cả các nồng độ vi khuẩn ở phương pháp xử lý bằng kít và phương pháp xử lý bằng nhiệt đều thấy 3 vạch DNA tương ứng với sản phẩm của 3 cặp mồi CPS 2J, Sly và 16S rDNA. Như vậy độ nhạy cũng như hiệu quả của phương pháp xử lý bằng nhiệt hoàn toàn tương đương với phương pháp xử lý bằng kit chuẩn. Như vậy, nhiệt độ 800C trong 60 phút là điều kiện đơn giản nhất để xử lý bệnh phẩm dịch não tủy có chứa vi khuẩn S. suis nhằm mục đích tách chiết được DNA sử dụng trong phản ứng PCR. Hiện nay, trên thị trường bộ kit dùng để tách chiết DNA có giá thành khá cao. Vì vậy, sự thành công của nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt độ sẽ góp phần đáng kể trong việc làm giảm giá thành của mỗi mẫu xét nghiệm, làm giảm gánh nặng về kinh tế cho người bệnh đặc biệt trong tình trạng kinh tế khó khăn như hiện nay.
Sp1-Sp5: mẫu bệnh phẩm lâm sàng (DNT) được xử lý ở 800C/60’ Ở cả 5 mẫu bệnh phẩm, vạch DNA ở vị trí kích thước 498 bp của cặp mồi đặc hiệu cho typ 2 của vi khuẩn S.suis đều xuất hiện rất rõ nét. Như vậy phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 800C trong 60 phút thích hợp để xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy để bộc lộ DNA của vi khuẩn S.suis.
Hình 3.13 cho thấy kết quả chạy PCR đa mồi trên 35 mẫu bệnh phẩm, trong đó có các mẫu bệnh phẩm 16, 17, 24, 25, 26, 31,32 không thấy xuất hiện sản phẩm của PCR đa mồi. Trong số các mẫu còn lại chủ yếu hiện 2 hoặc 3 vạch sản phẩm, chỉ có mẫu 8, 23, 27 và 29 là có 1 vạch sản phẩm. Để khẳng định lại kết quả phân tích, đối với những mẫu này có thể kiểm tra lại bằng phương pháp PCR đơn mồi. 3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định được vi khuẩn từ bệnh phẩm:Số bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán VMN mủ nghi do S. suis: 53 Số bệnh phẩm nuôi cấy phân lập xác định là S. suis : 44 mẫu (44/53 trường hợp nhiễm S. suis) Số bệnh phẩm xác định là S. suis bằng PCR đa mồi: 53 mẫu (53/53 trường hợp nhiễm S. suis )
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so với phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144
Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy, phương pháp PCR đa mồi phát hiện liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn khi so với nuôi cấy phân lập có độ nhạy đạt 100% và độ đặc hiệu đạt 100%. Trong trường hợp này tiêu chuẩn để xác định viêm màng não do S. suis là dương tính với 1 trong hai phương pháp là nuôi cấy phân lập hoặc PCR đa mồi Số mẫu được phân tích bao gồm: tổng số mẫu bệnh phẩm được chẩn đoán lâm sàng VMN mủ nghi do vi khuẩn S. suis là 53 mẫu và số mẫu âm tính thực sự (100 mẫu): n = 53 +100 = 153 Bảng 3.9. So sánh kết quả ba hai phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi và nuôi cấy phân lậpNCPL
Bảng 3.9 cho thấy kết quả phát hiện của PCR đơn mồi tương tự PCR đa mồi (có 3 cặp mồi khác nhau) và nhiều hơn phương pháp NCPL là 16,98%, nói cách khác tỷ lệ âm tính giả của NCPL là 16,98%. Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính xác và sự hữu ích của phương pháp PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập (n=153)
Kết quả ở Bảng 3.10 cho thấy, phương pháp PCR đa mồi phát hiện liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn có độ nhạy rất cao với 100%; trong khi đó phương pháp nuôi cấy có độ nhạy là 83,02%. Tỷ lệ âm tính giả của phương pháp PCR đa mồi là 0%, trong khi đó tỷ lệ âm tính giả của phương pháp nuôi cấy gần 17% (16,98%). Cả hai phương pháp đều có độ đặc hiệu 100% và tỷ lệ dương tính giả là 0%. Nếu xét nghiệm PCR đa mồi dương tính với vi khuẩn S. suis, xác xuất mắc bệnh là 100%, trong khi đó nếu nuôi cấy âm tính với S. suis, xác xuất không mắc bệnh do S. suis là 91,7%. Nói cách khác, giá trị dự đoán dương tính của PCR đa mồi và nuôi cấy là 100% và giá trị dự đoán âm tính của PCR đa mồi là 100% và của nuôi cấy là 91,7%. Với điều kiện ở Việt Nam hiện nay, có nhiều lý do giá trị âm tính trong nuôi cấy có nhiều khả năng là âm tính giả (do dùng kháng sinh trước khi vào bệnh viện, vi khuẩn bị kháng sinh ức chế không phát triển được trên môi trường nuôi cấy, do kỹ năng nuôi cấy không chuẩn, môi trường nuôi cấy không đảm bảo chất lượng…), nhưng bệnh phẩm vẫn chứa DNA của vi khuẩn nên vẫn có kết quả dương tính khi sử dụng phương pháp PCR, vói lý do như vậy nên các mẫu âm tính ở nuôi cấy nhưng dương tính ở PCR không thể coi là các mẫu âm tính thực (để tính theo công thức) được. Cũng như vậy, sẽ không chính xác nếu chỉ coi các mẫu bệnh phẩm phát hiện được vi khuẩn bằng nuôi cấy phân lập là tỷ lệ dương tính thực. Chúng tôi đã tính toán độ nhạy, độ đặc hiệu và các giá trị hữu ích khác khi áp dụng PCR đa mồi trên 153 mẫu bệnh phẩm (bao gồm 53 mẫu của bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não mủ nghi do vi khuẩn S. suis và 100 mẫu DNT của bệnh nhân viêm não do vi rut (dựa trên lâm sàng và xét nghiệm sinh hóa - tế bào của DNT) dựa trên nguyên tắc như sau:
Độ nhạy của mỗi phương pháp xét nghiệm khi so sánh với phương pháp được coi là ‘chuẩn vàng’ là tỷ lệ dương tính thực của mẫu bệnh phẩm mà xét nghiệm cần được so sánh có thể phát hiện được. Với cỡ mẫu là 144, phương pháp PCR đa mồi phát hiện liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn khi so với nuôi cấy phân lập có độ nhạy đạt 100% và độ đặc hiệu đạt 100%. Chỉ số LR+ cho thấy tỷ lệ dương tính thực của cả hai phương pháp như nhau và nếu đã phát hiện được vi khuẩn hay yếu tố di truyền của vi khuẩn thì chắc chắn là dương tính, chỉ số LR- cho thấy tỷ lệ âm tính giả của PCR đa mồi áp dụng với S. suis là 0%.
Ở phần phân tích này, cơ sở để thiết lập các bảng tính toán là: các mẫu được coi là dương tính khi có ít nhất một trong hai phương pháp dương tính và các mẫu âm tính khi cả hai phương pháp đều âm tính. Trong 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là VMN nghi do S. suis có 44 mẫu nuôi cấy dương tính, 09 mẫu nuôi cấy âm tính. Nếu phát hiện bằng PCR đa mồi có 100% số mẫu dương tính (53/53). Nếu tính theo quy định “viêm màng não xác định do S. suis là dương tính với 1 trong hai phương pháp: nuôi cấy phân lập hoặc PCR” thì độ nhạy của phương pháp nuôi cấy là 83,02% và độ nhạy của PCR đa mồi là 100% (Bảng 3.10), tính xác thực của PCR đa mồi được kiểm chứng với PCR đơn mồi (quy trình chuẩn của phòng thí nghiệm Liên cầu, Viện Quốc gia các Bệnh nhiễm trùng, Tokyo, Nhật Bản). Trong trường hợp này, độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi khi so sánh với nuôi cấy phân lập là 100% hay tỷ lệ âm tính giả của phương pháp PCR đa mồi là 0%, trong khi đó tỷ lệ âm tính giả ở phương pháp nuôi cấy xấp xỉ 17% (Bảng 3.10). Ngoài ra, chúng tôi sử dụng mồi tham khảo từ tài liệu khoa học đã công bố cho kỹ thuật PCR đa mồi thử nghiệm này nên tổ hợp mồi đã lựa chọn cũng đã được khảo sát tính đặc hiệu. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.74 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn: |