XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI)

3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI)

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không dùng kit

Kết quả khảo sát ở Bảng 3.7 cho thấy để xử lý‎ bệnh phẩm nhằm tách chiết DNA của vi khuẩn S. suis, biện pháp kết hợp ‘Kit + enzym mutanolysin’ cho phép phát hiện khi nồng độ vi khuẩn ở từ 50 - 10⁴vi khuẩn/pư (10⁷vk/ml), tương tự như phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm bằng ‘enzyme mutanolysin và nhiệt độ 100⁰C. Điều này có thể là do khi xử lý bằng kit có thể DNA đã bị mất đi trong quá trình tách chiết nên quy trình PCR kết hợp với xử lý bệnh phẩm bằng kit chỉ phát hiện được số lượng vi khuẩn ở nồng độ tương đối cao. Tuy nhiên việc xử lý mẫu bệnh phẩm bằng lyzozym ở 100⁰C chỉ có hiệu quả khi số lượng vi khuẩn ở nồng độ 10⁴ vk/pư.

Kết quả của việc xử lý mẫu bệnh phẩm bằng nhiệt độ đơn thuần, không sử dụng enzyme được minh họa như các hình dưới đây


M K10⁷ T1.10⁷ T1.10⁶ T1.10⁵ T1.10⁴ T2.10⁷ T2.10⁶ T2.10⁵ T2.10⁴ C (-)

Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 85⁰C và 90⁰C trong 60 phút

T1.10⁷ đến T1.10⁴: vi khuẩn chuẩn ở 4 nồng độ khác nhau và được xử lý ở nhiệt độ 85⁰C trong 60 phút

T2.10⁷ đến T2. 10⁴: vi khuẩn chuẩn ở 4 nồng độ khác nhau và được xử lý ở nhiệt độ 90⁰C trong 60 phút

Để đảm bảo tính tiết kiệm, nhóm nghiên cứu đã sử dụng quy trình PCR đơn mồi phát hiện typ huyết thanh 2 đã được xây dựng trong nghiên cứu trước đây để tiến hành thử nghiệm trên. Hình 3.9 cho thấy, khi xử lý mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ 85⁰C hoặc 90⁰C trong 60 phút thì chỉ thấy vạch DNA đích xuất hiện ở nồng độ 10⁷ và 10⁶vk/pư, còn ở nồng độ 10⁵ và 10⁴ vk/pư, không thấy xuất hiện vạch DNA. Như vậy khi xử lý bệnh phẩm ở các nhiệt độ trên chỉ phát hiện được vi khuẩn đến nồng độ 10⁶vk/pư.

M (+) T1.1 T1.2 T1.3 T2.1 T2.2 T2.3 T3.1 T3.2 T3.3 (-)

Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 80⁰C với thời gian ủ khác nhau

T1.1-T1.3: xử lý ở 80⁰C trong 35 phút với các nồng độ vk từ 10⁶ đến 10⁴

T2.1 – T2.3: xử lý ở 80⁰C trong 75 phút với các nồng độ vk từ 10⁶ đến 10⁴

T3.1 – T3.3: xử lý ở 80⁰C trong 90 phút với các nồng độ vk từ 10⁶ đến 10⁴

Hình 3.10 cho thấy, khi xử lý bệnh phẩm ở 80⁰C trong 35, 75 và 90 phút, ở tất cả các nồng độ vi khuẩn từ 10⁶ đến 10⁴ vk/pư đều không thấy xuất hiện vạch DNA đích. Như vậy phương pháp xử lý bệnh phẩm dịch não tủy ở điều kiện 80⁰C trong 35, 75 và 90 phút không đạt hiệu quả.