M 103 102 10 1 C (-) bp

Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm

với các thể tích mẫu khác nhau

A2: 2µl mẫu A, B2: 2µl mẫu B, A1: 1µl mẫu A, B1: 1µl mẫu B

Sự phù hợp về nồng độ của gen đích (hay luợng thể tích bệnh phẩm) với hàm lượng các thành phần cơ bản của phản ứng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các gen đích đó. Quá trình thử nghiệm của chúng tôi đã chứng minh sự ức chế quá trình tạo sản phẩm PCR trong phản ứng PCR đa mồi là do thể tích ’khuôn DNA’ lớn hơn yêu cầu gây nên. Trong những trường hợp nghi ngờ, để tăng khả năng phát hiện tối đa vi khuẩn có mặt trong bệnh phẩm, chúng tôi đã phải giảm thể tích khuôn đích (pha loãng bệnh phẩm và giảm thể tích khuôn đích) cùng với việc đảm bảo các điều kiện tối ưu khác của PCR.

Như vậy quy trình PCR đa mồi tối ưu được xây dựng như sau

Thành phần phản ứng:

• 
  Taq polymerase: 2,5 đơn vị/1 phản ứng
  
• 
  200µM mỗi loại dNTP
  
• 
  MgCl2: 2,5 - 3 mM/1 phản ứng
  
• 
  Thành phần và nồng độ các cặp mồi
  

• 
  Mồi 16SrDNA: 10 pmol/phản ứng;
  
• 
  Mồi Sly (enzyme ly giải): 10pmol/phản ứng;
  
• 
  Mồi cps2J (typ huyết thanh 2): 40pmol/phản ứng;
  

• 
  Thể tích mẫu: 1µl.
  

• 
  Thêm chu trình nhiệt phụ: có 3 chu kỳ của: 96⁰C x 3 phút; 60⁰C x 30 giây; 72⁰C x 1 phút.
  
• 
  Nhiệt độ bắt cặp thích hợp, thời gian và số chu kỳ hợp lý trong chu trình chính: là chu trình nhiệt thứ hai với 40 chu kỳ của: 94⁰C x 30 giây; 60⁰C x 30 giây; 72⁰C x 1 phút.
  
• 
  Thời gian kéo dài sản phẩm ở giai đoạn nhiệt cuối cùng: 72⁰C x 7 phút.
  

3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR được xây dựng (khả năng lặp lại kết quả)

Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô phỏng)

M: Thang chuẩn DNA; 1 = băng DNA đặc hiệu của typ huyết thanh 2 2 = băng DNA đặc hiệu S. Suis 3= băng DNA đặc hiệu enzym ly giải.

100vk: 1 ống phản ứng chứa 100 vi khuẩn 10 vk: 1 ống phản ứng chứa 10 vi khuẩn 01 vk: 1 ống phản ứng chứa 1 vi khuẩn

Với quy trình PCR đã xây dựng hoàn chỉnh, nhóm nghiên cứu đã thực hiện thử độ nhạy của quy trình trên các mẫu bệnh phẩm mô phỏng với các nồng độ từ 100 vk/phản ứng đến 01 vk/phản ứng. Kết quả cho thấy ở cả 3 nồng độ, tất cả các sản phẩm của 3 cặp mồi đều biểu hiện đầy đủ. Như vậy, mức độ phát hiện của quy trình đạt tới khoảng 01 vi khuẩn/phản ứng. So sánh với các quy trình đơn mồi và đa mồi đã được công bố thì kết quả của chúng tôi tương tự (chắc chắn phát hiện được 10 vi khuẩn/phản ứng) hoặc cao hơn (có khả năng phát hiện được 1 vi khuẩn/1 ống phản ứng)

Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm

Khả năng phát hiện (số vk/pư)	Độ lặp lại của kỹ thuật (10 lần thử nghiệm)
	Số lần lặp lại (%)	Số lần không lặp lại (%)
1	10/10 (100%)	0/10 (0%)

Ghi chú: Thử nghiệm áp dụng trên bệnh phẩm mô phỏng

PCR đa mồi 2 chu trình nhiệt độ Taqpolymerase: 2.5u

MgCl2: 2.5mM Tổ hợp mồi 1 với các hàm lượng khác nhau.

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành lặp lại thử nghiệm 10 lần. Mức độ phát hiện của PCR đa mồi đã đạt ≥ 1 vi khuẩn / phản ứng. Phản ứng PCR đa mồi với các điều kiện và thành phần tham gia đã tối ưu cho kết quả ổn định: luôn đạt ngưỡng phát hiện ≥ 1 copy (vi khuẩn)/ 1 ống phản ứng ở cả 10 lần thử nghiệm (100%).

3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis

500

300

Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp gen mồimồi & quy trình PCR đa mồi

M: thang DNA chuẩn 100bp

C(+): chứng dương (chủng chuẩn S. suis) thể hiện đủ 3 yếu tố của vi khuẩn.

Spn: chứng âm (với S. pneumoniae, cùng họ với S. suis)

Spy: chứng âm (với S. pyogenes)

Nm: chứng âm (với N. meningitidis; gây bệnh cảnh giống S. suis).

Hib: chủng vi khuẩn H. influenzae typ b gây bệnh VMN giống S. suis

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp mồi và quy trình PCR đa mồi. Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng các chủng vi khuẩn là tác nhân cùng họ và gây bệnh cảnh giống S.suis bao gồm S. Pneumoniae, S. pyogenes, S. pyogenes và H. influenza, ngoài ra còn sử dụng bạch cầu đơn nhân là loại tế bào chiếm số lượng lớn trong các mẫu bệnh phẩm. Kết quả thử nghiệm cho thấy chỉ có mẫu chứa tác nhân gây bệnh S.suis xuất hiện 3 vạch DNA tương ướng với sản phẩm của 3 cặp mồi được sử dụng. Ở các mẫu còn lại, không có mẫu nào xuất hiện sản phẩm của phản ứng PCR. Như vậy, quy trình PCR và tổ hợp mồi được xây dựng mang tính đặc hiệu cao, chỉ phát hiện S.suis mà không phát hiện được những loại vi khuẩn khác. Tính đặc hiệu của quy trình do nhiều yếu tố quyết định song trình tự các cặp mồi là yếu tố chủ yếu nhất. Ở đây, các cặp mồi là những trình tự đã được nghiên cứu và công bố đạt tính đặc hiệu cao (chỉ bắt cặp với trình tự đặc hiệu của vi khuẩn S. suis mà không bắt cặp với gen của những vi khuẩn khác).

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 0.74 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: