Gilbert M, Krajden M. Don’t wait to test for HIV. BC Medical Journal, 2010; 52(6): pp308

4. Gilbert M, Krajden M. Don’t wait to test for HIV. BC Medical Journal, 2010; 52(6): pp308.

6. Lee DZa, Eby W, Molinaro G. 1992. HIV false positivity after hepatitis B vaccination. The Lancet, 1992; 339(1060).

7. Papaevangelou V, Pollack H, Rigaud M, Arlievsky N, Lu ML, Rochford G, Krasinski K, Borkowsky W. The amount of early p24 antigenemia and not the time of first detection of virus predicts the clinical outcome of infants vertically infected with human immunodeficiency virus. The Journal of Infectious Diseases. 1996; 173: 574-8.

8. Pilcher CD, Eron JJ, Galvin S, Gay C, Cohen MS. Acute HIV revisited: new opportunities for treatment and prevention. Journal of Clinical Investigation, 2004; 113(7): 937-45.

9. Praharaj AK, Angadi K, Kalghatgi AT, Tripathy S, Sawhney MPS, Nagendra A. Early diagnosis of human immunodeficiency virus infection by p24 antigen detection. Medical Journal Armed Forces India, 2003; 59(4): 313-5.

10. Weber B, Fall EHM, Berger A, Doerr HW. Reduction of diagnostic window by new fourth-generation human immunodeficiency virus screening assays. Journal of Clinical Microbiology, 1998; 36(8): 2235-9.

Trẻ em nhiễm HIV chủ yếu do lây truyền từ mẹ sang con. Khoảng 15% trường hợp tiến triển nhanh xuất hiện ức chế miễn dịch nặng, mắc nhiễm trùng cơ hội trong những tháng đầu đời như viêm phổi do PCP, bệnh lý não nặng và chuyển sang giai đoạn AIDS nhanh. Nếu không được chăm sóc và điều trị ARV, khoảng 1/3 số trẻ này sẽ chết trong năm đầu tiên của cuộc đời và 50% số trẻ sẽ chết trước 2 tuổi [1, 2]. Điều trị bằng thuốc kháng virut HIV làm giảm tỷ lệ mắc nhiễm trùng cơ hội, phục hồi hệ miễn dịch, giảm tỷ lệ tử vong, kéo dài cuộc sống và nâng cao chất lượng sống cho trẻ nhiễm HIV [1].

Trẻ nhiễm HIV kháng thuốc có thể là do trẻ mắc phải virus đề kháng từ mẹ hoặc là do đột biến đề kháng xuất hiện do tiếp xúc với thuốc ARV trong điều trị dự phòng lây truyền mẹ con [3]. Trong quá trình điều trị bằng thuốc ARV việc kiểm soát các đột biến kháng thuốc đóng vai trò rất quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và làm giảm thất bại điều trị [4]. Hiện nay, xét nghiệm phát hiện HIV kháng thuốc dựa trên xét nghiệm kiểu hình hoặc kiểu gene [5]. Xét nghiệm kiểu gen (Genotypic testing): là tìm kiếm các đột biến đặc hiệu có thể gây kháng thuốc trong cấu trúc gen của các enzyme sao chép ngược (Reverse Transcriptase-RT) và protease (Protease inhibitor-PI). Xét nghiệm kiểu hình (Phenotypic testing): là đo lường khả năng sinh trưởng của virus trong môi trường có các nồng độ thuốc ARV đã biết. Mục tiêu nghiên cứu: nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và xác định tỷ lệ đột biến kháng thuốc ARV ở trẻ nhiễm HIV tại Bệnh viện Nhi Trung ương.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng

Tất cả trẻ được khẳng định nhiễm HIV từ 1 tháng đến 15 tuổi, khám và theo dõi định kỳ tại phòng khám ngoại trú khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 01/2010 đến tháng 10/2011.

Chẩn đoán xác định nhiễm HIV ở trẻ em theo quy trình chẩn đoán nhiễm HIV của WHO [1]: Đối với trẻ dưới 18 tháng tuổi làm xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) máu phát hiện DNA hoặc RNA của virút. Với trẻ ≥ 18 tháng tuổi làm xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV.

2. Phương pháp nghiên cứu

Tất cả trẻ được khám lâm sàng, làm xét nghiệm trước khi điều trị ARV, sau 6 tháng điều trị ARV trẻ được khám, làm xét nghiệm đánh giá lại lần 2.

Mẫu máu của trẻ nhiễm HIV được tách chiết HIV-1 RNA. Sử dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) để phát hiện trình tự vùng gen pol của HIV-1 mã hóa đoạn Protease (PR) và vùng gen sao mã ngược pol-Reverse Transcriptase (RT). Xét nghiệm này được làm tại khoa sinh học phân tử - Bệnh viện nhi trung ương. Các đột biến kháng thuốc trên các vùng gen PR và RT được phân tích thông qua việc sử dụng dữ liệu đột biến kháng thuốc của trường đại học Stanford.

Chỉ định điều trị ARV theo tiêu chuẩn của Tổ chức y tế thế giới (WHO) - 2009. Trẻ < 12 tháng tuổi: điều trị ngay, không phụ thuộc vào giai đoạn lâm sàng và tế bào CD4. Trẻ từ 12 tháng tuổi trở lên, chỉ định khi: Giai đoạn lâm sàng 3, 4 và không phụ thuộc tế bào CD4. Giai đoạn lâm sàng 1, 2 và tế bào CD4 ở dưới ngưỡng “Suy giảm nặng“ theo lứa tuổi.

Điều trị ARV gồm 3 thuốc, phác đồ bậc 1 là 2 NRTIs + 1 NNRTIs hoặc phác đồ bậc 2 là 2 NRTIs + 1 PI, tùy theo tình trạng lâm sàng của trẻ theo hướng dẫn của WHO [1].

KẾT QUẢ

140 trẻ được theo dõi và làm xét nghiệm tìm đột biến gen kháng thuốc trước điều trị ARV, điều trị ARV sau 6 tháng có 15 trẻ được làm xét nghiệm lần 2. Tỷ lệ tử vong trong thời gian nghiên cứu là 22/140 (15,7%) trong đó nhóm trẻ dưới 3 tuổi chiếm 72,7%.

Tỷ lệ nam/nữ là 1/1,1 (67/73).

Tuổi trung bình là 4,2 ± 3,0 tuổi, thấp nhất là 1 tháng tuổi, nhiều nhất là 12 tuổi.

Bảng 1: Phân loại theo giai đoạn lâm sàng

Nhận xét: Giai đoạn lâm sàng 3 và 4 chiếm tỷ lệ 43,6%

Bảng 2: Phân loại theo giai đoạn miễn dịch

(Tính theo tỷ lệ % hoặc số lượng tế bào CD4 theo nhóm tuổi)

Nhận xét: Mức độ suy giảm miễn dịch nặng chiếm tỷ lệ 56,4%.

Bảng 3: Tải lượng virut (copies/ml)

Nhận xét: Bệnh nhân có tải lượng virut cao chiếm tỷ lệ 59,4%.

Bảng 4: Một số nhiễm trùng cơ hội gặp trong thời gian nghiên cứu

Nhiễm trùng cơ hội	n	Tỷ lệ %
Nấm miệng Candida	62	44,3
Phát ban sẩn ngứa	45	32,1
Viêm phổi nặng	42	29,3
Herpes zoster	10	7,1
Lao phổi	8	5,7
Nhiễm nấm Penicillium marneffei	5	3,6
Bệnh lý não do HIV	2	1,4

Nhận xét: Nhiễm trùng cơ hội (NTCH) gặp nhiều nhất là nấm miệng Candida 44,3%, phát ban sẩn ngứa 32,1%, viêm phổi nặng 29,3%.

Tỷ lệ tử vong chung 15,7% (22/140), trong nhóm điều trị ARV 17,6% (18/102), trong nhóm chưa điều trị ARV 10,5% (4/38). Tỷ lệ tử vong trong số mắc nhiễm trùng cơ hội là 27,5%.

- Xác định tỷ lệ đột biến kháng thuốc ARV ở trẻ nhiễm HIV

Tỷ lệ đột biến kháng thuốc ARV ở trẻ nhiễm HIV chưa điều trị thuốc kháng virut, vùng Protease (PR) là 2/140 (1,4%), vùng gen sao mã ngược (Reverse Transcriptase-RT) là 23/140 (16,4%) trong đó nhóm NRTIs là 11/140 (7,9%) và nhóm NNRTIs là 12/140 (8,6%). Có 2/140 (1,4%) xuất hiện đột biến cả với nhóm NRTI và NNRTI. Không có bệnh nhân nào xuất hiện đột biến đồng thời cả nhóm PI và nhóm RT.

Bảng 5: Tỷ lệ đột biến kháng thuốc trước điều trị ARV

Trong 140 trẻ nhiễm HIV chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về giới (67 nam và 73 nữ). Đây là sự khác biệt giữa nhiễm HIV ở trẻ em và người lớn - trong khi trẻ em không có sự khác biệt về giới thì tỷ lệ nhiễm HIV ở nam trưởng thành cao hơn nữ giới. Tuổi trung bình là 4,2 ± 3,0 tuổi, thấp nhất là 1 tháng tuổi, nhiều nhất là 12 tuổi. Như vậy trẻ nhiễm HIV đã được tiếp cận với dịch vụ y tế sớm hơn, cùng với xét nghiệm chẩn đoán sớm cho trẻ dưới 18 tháng có thể giúp cho trẻ được điều trị ARV sớm làm giảm tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng cơ hội [6].

Giai đoạn lâm sàng 3,4 chiếm 43,6%, trong khi đó mức độ suy giảm miễn dịch nặng chiếm 56,4% và tải lượng virut ≥5000 copies chiếm 59,4%. Như vậy có một số đáng kể trẻ nhiễm HIV không có biểu hiện trên lâm sàng nhưng có tải lượng virut cao và suy giảm miễn dịch nặng, vì vậy ngoài việc theo dõi lâm sàng cần theo dõi các xét nghiệm để có thể chỉ định điều trị ARV đúng thời điểm là rất cần thiết.

Tỷ lệ tử vong chung 22/140 (15,7%) trong nhóm điều trị ARV là 18/102 (17,6%), trong nhóm chưa điều trị ARV là 4/38 (10,5%). Mặc dù được điều trị ARV tỷ lệ tử vong ở trẻ nhiễm HIV vẫn còn cao có thể là do tỷ lệ trẻ ở giai đoạn lâm sàng nặng, có suy giảm miễn dịch cao kèm theo nhiễm trùng cơ hội nặng. Tỷ lệ tử vong trong nhóm chưa được điều trị ARV cũng do trẻ vào viện trong giai đoạn lâm sàng nặng và tử vong do bệnh nhiễm trùng cơ hội.

Tỷ lệ đột biến kháng thuốc ARV ở trẻ nhiễm HIV chưa điều trị thuốc kháng virut, vùng Protease (PR) là 2/140 (1,4%), vùng gen sao mã ngược (Reverse Transcriptase-RT) là 23/140 (16,4%) trong đó nhóm NRTI là 11/140 (7,9%) và nhóm NNRTI là 12/140 (8,6%). Theo một khảo sát trong năm 2008 do Tổ chức Y tế Thế giới tiến hành ở một số nước Châu Phi và Châu Á, tỷ lệ kháng thuốc trước điều trị là 5% [7]. Một nghiên cứu khác do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương tiến hành năm 2008 trên 70 mẫu máu cho kết quả với tỷ lệ kháng dưới 5% [8]. Theo P.T.T và cs [9] nghiên cứu năm 2008 thì tỷ lệ các đột biến kháng thuốc trong số những bệnh nhân chưa điều trị ARV ở phía Bắc Việt Nam là 4,5% ở nhóm RT và 1,7% ở nhóm PI. Như vậy tỷ lệ đột biến ở nhóm RT trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với những nghiên cứu trước đây, tuy nhiên tỷ lệ đột biến ở nhóm PI là vẫn thấp. Điều này có thể là do hiện nay số lượng người nhiễm HIV đã được tiếp cận với các dịch dụ chăm sóc và điều trị ARV ngày càng tăng. Việc sử dụng thuốc kháng virut đã chứng minh hiệu quả rõ rệt trong việc kiểm soát sự nhân lên của virut HIV, nhưng có thể dẫn đến sự phát triển của đột biến kháng thuốc.

Trong số bệnh nhân nhiễm HIV trước điều trị ARV có đột biến gen kháng thuốc có tiền sử được điều trị dự phòng lây truyền mẹ con là 1/23 (4,3%) chiếm tỷ lệ thấp. Như vậy đột biến xảy ra có thể là do từ mẹ đã nhiễm sẵn virut mang gen đột biến.

Các đột biến chọn lọc ở nhóm NRTIs là phức hợp đột biến chèn tại điểm 69 chiếm tỷ lệ 50%; đột biến M184I cũng được tìm thấy là đột biến kháng cao với thuốc Lamivudin (3TC) trong phác đồ điều trị bậc 1 hay đột biến K65R đề kháng với các thuốc Tenofovir (TDF), Abacavir (ABC), Didanosine (ddI) trong phác đồ điều trị bậc 2, hay đột biến Q151M kháng với tất cả các thuốc trong nhóm NRTI; các đột biến TAMs (là các đột biến tương tự Thymidine) như L210W. Khi xuất hiện đột biến chèn tại điểm 69 cùng với ít nhất một đột biến TAMs ở các vị trí 41, 210 hay 215 thì sẽ đề kháng với tất cả các thuốc NRTIs. Các đột biến chọn lọc ở nhóm NNRTIs chủ yếu là V106I (5/14 điểm đột biến) và V179D (5/14 điểm đột biến) tiếp đến là Y181C (2/14 điểm đột biến), K101E và M230L. Trong số các đột biến nhóm NNRTIs thì đột biến Y181C kháng cao với Nevirapin (NVP) và Efavirenz (EFV). Các đột biến được tìm thấy ở nhóm PI là M46L và L90M với tỷ lệ đột biến chung là thấp. Các đột biến được tìm thấy chủ yếu ở những trẻ không được dự phòng lây truyền mẹ con, chưa từng tiếp xúc với ARV, điều này có thể là do trẻ mắc phải virut đề kháng từ mẹ.

KẾT LUẬN

Trẻ em nhiễm HIV không có sự khác biệt về giới, tỷ lệ có suy giảm miễn dịch nặng cao (56,4%), tỷ lệ tử vong 15,7% chủ yếu ở nhóm dưới 3 tuổi chiếm 72,7%. Tỷ lệ đột biến kháng thuốc vùng gen sao mã ngược (RT) ở bệnh nhân chưa điều trị thuốc kháng vi rút cao (15%) và xuất hiện nhiều loại đột biến trong nhóm NRTIs gây kháng thuốc trong điều trị ARV. Vì vậy, việc làm xét nghiệm phân tích kiểu gen cho trẻ nhiễm HIV trước khi điều trị ARVlà cần thiết để lựa chọn phác đồ phù hợp làm giảm nguy cơ thất bại điều trị và tỷ lệ kháng thuốc ARV.

1. WHO. Antiretroviral therapy for HIV infection in infants and children: Towards universal access. Recommendations for a public health approach 2010 revision.

2. Andrew Prendengast, et al. International perspectives, progress, and future challenges of paediatric HIV infection. The Lancet, vol 370, issue 9581, p. 68-70, July 2007.

3. Flys T., et al. Nevirapine resistance in women and infants after first versus repeated use of single dose nevirapine for prevention of hiv-1 vertical transmission. Journal Infectious Disease, 2008; vol 198 (4), p. 465 – 69.

4. Kim CE sigaloff, Job CJ Calis, Sibyl P Geelen, et al. HIV-1-resistance-associated mutations after failure of first-line antiretroviral treatment among children in resource-poor regions: a systematic review. The Lancet Infectious Diseases, vol 11, issue 10, p. 769-79, October 2011.

5 François Clavel and Allan J. Hance. HIV drug resistance. The New England Journal of Medicine; vol 350, p. 1023-35, March 2004.

6. Avy Violari, F.C.Paed., Mark F. Cotton, et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. The New England Journal of Medicine; vol 359, p. 2233-44, November 2008.

7. Bennett D.E, et al. Recommendation for surveillance of transmitted HIV drug resistance in countries scaling up antiretroviral treatment. Antiviral Therapy 2008; vol 13, Suppl 2, p. 25-36.

8. Hien Tran Nguyen, et al. HIV drug resistance threshold survey using specimens from voluntary counseilling and testing sites in Hanoi, Vietnam. Antiviral Therapy 2008; vol 13, Suppl 2, p. 115-121.

9. Phan T.T., et al. Characterization of HIV type 1 genotypes and drug resistance mutations among drug-naive HIV type 1-infected patients in Northern Vietnam. AIDS Res Hum Retroviruses, 2010; vol 26(2): p. 233-35.

Polymerase chain reaction for HIV DNA is the gold standard for HIV diagnosis in infant (Draft DBS collection training manual, 2009). It was specific as viral culture (Ammann & Burrowes, 2007). According to World Health Organization, the diagnosis of HIV infection in HIV-exposed infants should perform at six weeks old and six weeks after complete cessation of breast feeding (Pediatric HIV Diagnosis and Laboratory Monitoring, 2006). Whole blood has already used in Amplicor HIV DNA test. But the use of whole blood has some disadvantages such as collection of large amount of blood from infant, difficult in storage and transportation of whole blood especially for the distant PMCT sites. DBS techniques was widely used in new born screening, therapeutic drug monitoring and for trials in remote area (Spooner et al, 2009). Since 1987, Edward McCabe reported successfully extracting DNA from DBS (McCabe et al, 1987). Therefore, DBS became the choice of specimen collection in diagnosis of HIV infection for infants. Many studies have performed the stability of HIV DNA in DBS and the various methods for HIV DNA extraction from DBS have been investigated. In Myanmar, the results of HIV-1 DNA from whole blood and DBS were compared during the one year period. We used low resource settings for storage of DBS to be similar in the environmental conditions of PMCT sites. For extraction of viral nucleic acid from DBS, the extraction reagent from Ampicor HIV-1 DNA test was used in a simple procedure.

1.To determine the presence of HIV DNA in Whole Blood by Polymerase Chain Reaction in infants older than 6 weeks.

2.To determine the presence of HIV DNA in Dried Blood Spots by Polymerase Chain Reaction in infants older than 6 weeks.

3.To compare the results of HIV DNA using Whole Blood and Dried Blood Spots.

A cross-sectional laboratory-based comparative study was done for whole blood and dried blood spot (DBS) samples by Amplicor HIV-1 DNA PCR test, version 1.5 (Roche Molecular systems).

Whole blood of 50 HIV-exposed children delivered from HIV infected mother included in PMCT program were collected from April 2010 to March 2011. Whole blood 1 ml was collected in K₃-EDTA tube and transported by cold chain to National Health Laboratory, Ministry of Health, the Republic of Union of Myanmar. Preparation of cell pellet from 500 µl whole blood was done by washing three times with sodium phosphate solution as soon as possible or within 24 hours and stored at -70ºC. Fifty microliter of fresh whole blood was soaked onto each circle of Whatman 903 DBS card. All specimen cards were dried overnight in a suspended horizontal position using cardboard drying racks without touching the part of the card where blood was applied. Once DBS were completely dried, DBS card of each sample was stored in a sealable plastic bag with dessicant. All DBS samples were placed in a plastic box to prevent direct sun light and stored at least 2 weeks at room temperature before extraction.

Cell pellet was used as manufacturer’s instruction.

Four 3 mm circles from DBS were put in a 2ml-sterile polypropylene screw-cap tubes and mixed with 500 µl phosphate buffered saline and vortexed. They were left for 5 minutes at room temperature, centrifuged at 80,000 rpm for 1 minute and then the supernatant was pipetted off. Washing step was repeated again. Washed DBS and 200 µl of extraction reagent containing internal control were incubated at 60 ºC (heat block) for 15 minutes and at 100 ºC (heat block) for 15 minutes. Then, the mixture was briefly vortexed and micro-centrifuged at high speed for few seconds and supernatant was used for amplification.

Polymerase Chain Reaction Amplification was done on 155 basepairs of gag gene using Amplicor HIV-1 DNA test kit. Three AMPLICOR HIV-1 Negative Controls and one AMPLICOR HIV-1 Positive Control were included in every batch of testing. For each sample, HIV-1 internal control was added from each sample extraction step. It served as an extraction and amplification control for each independently processed sample.

The results of the whole blood were considered as gold standard for this study. DBS results were 100% concordance with that of whole blood.

Table. Comparison of HIV – 1 DNA test results from Whole Blood and Dry Blood Spot samples

		HIV – 1 DNA test results from Whole Blood samples
		Positive	Negative	Total
HIV – 1 DNA test results from Dry Blood Spot samples	Positive	13	0	13
	Negative	0	37	37
	Total	13	37	50

from (Accessed on April 2, 2010). Kappa = 1.00 (95% confidence interval = 0.82 to 1.00), p < 0.001

In one year study period, 50 whole blood and 50 DBS samples were detected for HIV-1 DNA. DBS results were comparable to whole blood result showed 13 positive and 37 negative.

Leelawiwat et al (2008) studied assays for HIV-1 diagnosis using infants DBS from Thailand. DBS sample stored at four different temperatures(-70ºC,-20 ºC, 37 ºC, 25 ºC) were evaluated using the modified DNA PCR v1.5 assay. HIV-1 DNA in DBS appeared to be stable up to 9 months at most temperatures.

Myanmar has generally a tropical monsoon climate. It has three seasons : rainy, cold and hot season. Temperature and humidity varies with the season. The study period (from April 2010 to March 2011) covered all the seasons of Myanmar. The results of DBS were reliable compared to whole blood results in the climate condition of Myanmar, as there was 100% concordance in the results.

DBS were stored at least 2 weeks before extraction and amplification. (We refer two weeks to transportation time in the country). Fourteen percent of DBS were tested after 5 weeks of collection. One DBS sample, which showed positive at 2 weeks after collection, was stored up to 43 weeks (9.3 months). It remained positive without reduction in optical density of ELISA result on the second time testing.

For HIV-1 DNA extraction from DBS, many reagents such as Chelex 100 (Fischer et al, 2004), phenol-chloroform mixture and silica (Mitchell et al, 2008), proteinase (Amplicor HIV-1 DNA Test, version 1.5) had been used in various studies. Different procedure on extraction steps had also been performed using Amplicor HIV-1 DNA kit extraction reagent.

In this study, HIV-1 DNA from DBS was extracted using reagent from whole blood test kit in a simple procedure. The extraction step was done in a single tube which may reduce cross contamination. For PCR inhibition detection, the internal control was used together with the sample from the beginning of the extraction step.

According to the acquired data from receiver operating characteristic curve, the optimal cut off points for optical density will be around 1.2 – 1.4 (with 100% sensitivity and specificity). Since the positive cut off for the whole blood test kit was described as 0.8; that value can also use in dry blood spot test without sacrificing the sensitivity and specificity.

Practically, DBS samples were easy to collect and transport. DBS samples had advantages in storage condition that was similar in PMCT sites which had no special electrical equipment. It had low level of biohazard than whole blood.

The usage of DBS can be expected to expand the laboratory diagnosis in the whole country of Myanmar for early infant diagnosis of HIV infection. This will also maintain the efficiency of the PMCT programs and also early care and support for the infected as well as uninfected infants.

REFERENCES

1. Draft DBS collection training manual (2009), Ministry of Health, Vietnam.

2. Ammann, A., Burrowes, S. (2007), Early Diagnosis of HIV Infection in HIV-Exposed Infants: Can complexity and cost be overcome in resource poor setting?, Women, Children ad HIV Resources for prevention and treatment, Medical center, University of Califonia, San Francisco, Available from