BÁo cáo kết quả ĐỀ TÀi nghiên cứU oOo nghiên cứu chọn giống lúa phẩm chất cao thông qua công nghệ di truyền phục vụ TỈnh hậu giang danh sách những người thực hiện đề tài

2. 
   Đánh giá chất lượng và số lượng DNA
   

Kỹ thuật điện di trên gel là kỹ thuật làm hiển thị trực tiếp các acid nucleic. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là các acid nucleic mang điện tích âm ở pH trung tính nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của chúng nên các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm keo (agarose gel hoặc arcrylamine gel) có tác dụng tách các phân tử DNA theo kích thước.

Agarose là một dạng của polysaccharide có tính chất tạo keo lỏng khi tan (melting) ở nhiệt độ cao và kết tụ lại (gelling) ở nhiệt độ thấp. Khi đặc lại giữa những hạt agarose có những lỗ hổng rất nhỏ. Kích thước những lỗ này có thể xê dịch chút ít tuỳ theo nồng độ của agarose gel. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự va chạm giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực cản. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh nên DNA có phân tử nhỏ di chuyển nhanh. Nhờ vậy người ta phân loại được các đoạn DNA trên agarose gel. Để có được kết quả mong muốn khi nghiên cứu các đoạn DNA, cần có sự tương xứng giữa nồng độ gel và kích thước đoạn DNA cần phân tách (Nguyễn Thị Lang, 2002) như sau:

Nồng độ Agarose (%) Kích thước đoạn DNA (kb)

0,5 1 - 30

0,7 0,8 - 12

1,0 0,5 - 10

1,2 0,4 - 7

1,5 0,2 - 3

Acryramide keo < 0,5

Sau khi điện di, các đoạn DNA được phân tách ra tuỳ theo trọng lượng phân tử. Người ta có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA với ethidium bromide và hiển thị trong tia cực tím.

• 
  Pha dung dịch 1 X TAE và rót vào hộp điện di.
  
• 
  Đo kích thước khay và tính toán thể tích gel cần nấu.
  
• 
  Lấy dung dịch 1 X TAE theo thể tích đã tính để pha nồng độ agarose gel 0,9%.
  
• 
  Đun sôi dung dịch agarose trong lò vi sóng (microwave) đến khi tan hoàn toàn và đúng thể tích.
  
• 
  Làm nguội dung dịch agarose trên máy lắc đến nhiệt độ khoảng 55⁰C, rót nhẹ nhàng vào khay điện di (chú ý tránh bọt khí).
  
• 
  Chuẩn bị mẫu DNA cho loading: 5 – 10 μl DNA + 4 μl dung dịch nhuộm (loading buffer)
  
• 
  Chạy điện di và chụp ảnh gel dưới tia UV
  
• 
  Dựa trên băng hình xuất hiện DNA đánh giá số lượng DNA
  

1. 
   Chuẩn bị kính để chạy gel
   

1. 
   Rửa kính thật sạch qua nước và nước rửa với giấy mềm hoặc bọt biển, đặt kính đứng để mau khô.
   
2. 
   Đối với kính dài: mang bao tay để rửa. Rửa 3 lần với cồn 95% và dùng giấy kimwipes. Trộn 1% cồn, 5 (l acid glacial acetic, 3 (l bind silane).
   
3. 
   Dùng pipet man lấy 1 ml dung dịch Bind Silane đặt nhẹ trên kính, chú ý phải phủ đều dung dịch này trên kính.
   
4. 
   Lấy giấy Kimwipe lau sạch
   
5. 
   Sau 5 - 10 phút phơi khô và rửa cồn 95%. Lăp lại giai đoạn này 2 - 3 lần
   
6. 
   Đối với kính ngắn
   
7. 
   Thay bao tay trước khi rửa
   
8. 
   Dùng pipetman, lấy 1 ml SigmaCode đặt phủ trên toàn tấm kính
   
9. 
   Sau 5 - 10 phút dùng cồn 95% rửa tiếp với kimwipes
   
10. 
    Chuẩn bị khung kính
    
11. 
    Đặt kính ngắn trên bàn.
    
12. 
    Lấy hai dây đặt hai đầu.
    

2. 
   Chuẩn bị đổ gel
   

1. 
   Chuẩn bị 5% acrylamine gel trong 100 ml trước khi đổ gel
   
2. 
   Thêm 50 µl TEMED và 600 μl 10% ASP (ammonium persulfaate)
   
3. 
   Nhẹ nhàng đưa gel vào khung bằng cách dùng ống bơm. Chú ý tránh bọt khí. Sau khi đưa gel vào khung, đặt lược (comb) vào. Kế đến dùng giấy plastic phủ các đầu gel, tránh làm khô gel.
   
4. 
   Sau hai giờ chúng ta có thể loading
   

3. 
   Chạy Acrylamide gel
   

1. 
   Đổ 500 ml 1 X TBE vào phòng trên
   
2. 
   Tiếp tục đổ 500 ml 1 X TBE vào phòng dưới
   
3. 
   Nối điện và cho chạy. Khởi động ban đầu 2500V, 150mA và 90W.Giai đoạn này chạy nóng khoảng 30 phút.
   

1. 
   10 μl loading thêm vào mỗi probe 8 µl thể tích từ phản ứng PCR
   
2. 
   Đặt phản ứng này vào máy thermocycler (5 phút) ở nhiệt độ 94⁰C
   
3. 
   Đặt mẫu vào đá ngay tức khắc sau khi biến tính (denature)
   
4. 
   Tắt điện và chuẩn bị loading
   
5. 
   Ghi nhãn cẩn thận
   
6. 
   Rửa các giếng cẩn thận
   
7. 
   Loading: 10 µl mẫu đưa vào giếng
   
8. 
   Khởi động máy trở lại với 2500 volt,120 A và 70 W. Sau khi loading mẫu đầu tiên khoảng 30 phút. Tiếp tục loading mẫu thứ hai và trên một gel có thể loading 4 set
   
9. 
   Khi gel đặc hoàn toàn, thời gian có thể thay đổi tuỳ theo loading chậm hay nhanh. Tắt điện và di chuyển gel ra ngoài. Chú ý mở buồng trên và đổ buffer vào một cal nhựa để dành cho gel đợt sau.
   
10. 
    Di chuyển gel ra khỏi tấm kính
    
11. 
    Mở ốc. Một tay nâng kính ngắn. Ngón tay trỏ nâng từ từ tấm kính dài và tách khỏi tấm kính ngắn.
    
12. 
    Gel nằm và dính chặt trên tấm kính dài
    

1. 
   Gel nằm và dính chặt trên tấm kính dài.
   
2. 
   Đặt kính và gel vào bể có chứa 10% acid acetic (dung dịch này gọi là dung dịch cố định (thời gian 20 - 25 phút). Dung dịch này giữ lại để dùng trong giai đoạn 7
   
3. 
   Rửa nước (hai lần trong 2 phút)
   
4. 
   Nhuộm dung dịch bạc (30 phút) cho lần nhuộm thứ nhất. Nếu nhuộm lần thứ hai 45 phút và nhuộm lần ba 60 phút. Do đó dung dịch này có thể giữ và dùng nhiều lần
   
5. 
   Rửa gel (rất nhanh 20 giây)
   
6. 
   Rửa phim: Giai đoạn này nhanh hay mau tùy theo phản ứng
   
7. 
   Đưa sang dung dịch cố định phim
   
8. 
   Rửa nước: chú ý rửa nhanh đảo 10 lần lấy ra
   
9. 
   Phơi khô: dựng trên giá để cho gel mau khô, chú ý ghi nhãn cẩn thận
   
10. 
    Đếm băng, trên đèn và scan trên máy
    

6. 
   Phân tích số liệu
   
   1. 
      Phân tích sự ổn định theo mô hình Eberhart và Russel (1966)
      

Ij = (Yij / V) - (Yij/ vn)

• 
  Yij = Trung bình của giống I ở môi trường j
  
• 
   = Giá trị trung bình tổng thể của các giống qua tất cả các môi trường
  
• 
  β = Hệ số hồi quy của giống thứ I trên chỉ số môi trường, tham số để đo lường phản ứng của giống đối với sự thay đổi môi trường.
  
• 
  Ij = chỉ số môi trường. n tích thông số ổn định được tính tóan
  
• 
  A/ b_i = å Yij Ij/ å I 2j
  
• 
  Trong phần này sẽ cho hai chỉ số
  
• 
  Chỉ số môi trường
  
• 
  Chỉ số b_i (thích nghi)
  

• 
  Có thể dùng nhiều nghiệm thức (genotypes, phân bón và các chỉ tiêu khác)
  
• 
  Đánh giá kết quả chính xác hơn, dựa trên mô hình biplot
  
• 
  Nhanh hơn, rút ngắn thời gian từ 3 năm xuống 2 năm
  
• 
  Qua phân tích chúng ta có thể đề nghị nhanh các giống từ khảo nghiệm thành giống phục vụ cho chương trình chọn giống
  

mabålgdq

• 
  : trung bình
  
• 
  : trung bình của kiểu gen
  
• 
  : trung bình của môi trường
  
• 
  : hợp phần của PCA n
  
• 
   và (en: môi trường PCA và kiểu gen được đếm
  
• 
  : Là số PCA : Hệ số cặn)
  

2. 
   Phân tích đa dạng hóa nguồn gen theo phần mềm Popgene
   

Khoảng cách đo bằng công thức chung của Nei ‘S

Dùng Popgen xem như công cụ đo khoảng cách và mối liên hệ của chúng thông qua dominant và codominant của các giống.

7. 
   Khuếch đại DNA thông qua microsatellite (SSR)
   

Bảng 16: PCR buffer (10 X) pha trong 5 ml

• 
  Bốn deoxynucleotid (dNTPs)
  
• 
  Hai oligonucleotid primer (Reverse, Forward)
  
• 
  DNA template
  
• 
  DNA polymerase
  

1. 
   Các thành phần dung dịch thường đặt trong tủ lạnh -20⁰C hoặc -80⁰C
   
2. 
   Ghi nhãn cẩn thận trên trên micro tab (tube đặc biệt dùng để chạy PCR) hoặc sơ đồ theo hệ thống 96 giếng cho PCR
   
3. 
   Chuyển 1 μl DNA template vào micro tab.
   
4. 
   Chuẩn bị pha dung dịch PCR cocktail. Trộn đều và ly tâm.
   
5. 
   Dùng pipette lấy 19 μl dung dịch PCR cocktail cho vào mỗi tube có chứa sẵn DNA.
   
6. 
   Lấy một giọt dầu (mineral oil) phủ lên trên nhằm tránh bốc hơi dung dịch.
   
7. 
   Đặt ống nghiệm vào máy PCR, khởi động và vận hành máy theo chu trình.
   
8. 
   Lấy mẫu ra khỏi máy khi hoàn thành chu trình.
   
9. 
   Trữ ở nhiệt độ 4⁰C
   
10. 
    Phân tích sản phẩm bằng điện di trên agarose gel 3%, đệm TAE 1 X, trong 1giờ 30 phút
    

8. 
   Phân tích QTL
   

Thông thường người ta rất khó xác định vị trí chính xác và hoạt động gen của các loci tính trạng số lượng. Để khắc phục nhược điểm trên người ta thành lập các nguồn vật liệu di truyền có tính trạng được biết rõ ràng như các dòng gần đẳng gen (NIL) mang một hoặc nhiều đoạn nhiễm sắc thể của bố mẹ trên nền tảng di truyền của một dòng bố mẹ khác.

9. 
   Phân tích đa dạng di truyền
   

Các bước phân tích bao gồm:

• 
  Thu thập số liệu
  
• 
  Trắc nghiệm mức độ ý nghĩa
  
• 
  Chuyển đổi các giá trị
  
• 
  Tính hiệu số D²
  
• 
  Trắc nghiệm mức độ ý nghĩa của D² với phép thử Chi bình phương
  
• 
  Mức độ đóng góp của các tính trạng vào sự phân nhóm
  
• 
  Xếp nhóm các cluster di truyền
  

Theo Bùi Chí Bửu (2003) hiện nay người ta có xu hướng phân nhóm đa dạng di truyền ở mức độ phân tử, như vậy sự chính xác sẽ cao hơn rất nhiều so với phương pháp truyền thống dựa trên tính trạng hình thái học. Phân tích nhóm (cluster analysis) thật ra là phương pháp sắp xếp các giống thành những cụm nhóm khác nhau trên cơ sở mức độ giống nhau theo qui ước (aglomerative clustering) được thực hiện theo qui trình tiêu chuẩn qua các bước sau:

• 
  Tìm các cặp (i, j) có giá trị khoảng cách nhỏ nhất (hoặc giống nhau nhất)
  
• 
  Nhập các cặp này lại thành một nhóm (cluster)
  
• 
  Tạo ra nhóm lớn hơn tương ứng với nhóm mới sao cho các cặp (i, j) mới tương thích với giá trị mức độ giống nhau.
  
• 
  Lặp lại qui trình đến hết.
  

4. 
   KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
   
   1. 
      Ứng dụng công nghệ phân tử trong chọn dòng lúa đặc sản
      

Đối với các giống cao sản cần có năng suất cao, kháng được điều kiện sâu bệnh, ngắn ngày để khai thác tiềm năng năng suất cũng được làm vật liệu lai trong chương trình.

1. 
   Phân tích trên tính trạng độ trở hồ
   

Phân tích độ trở hồ (GT) trên giống lúa mùa có nhiều giống cấp 2 và có nhiều giống cả cấp 2 và cấp 7 (như Nanh Chồn) hoặc Nàng Hương (cấp 3, 4 và 5, 7). Sự đánh giá này cho thấy rằng cần phải nghiên cứu chính xác về kiểu gen của từng giống, hơn nữa độ trở hồ còn tuỳ thuộc mạnh vào điều kiện môi trường. Hầu hết thuộc nhóm GT cao do đó thời gian nấu cơm lâu hơn.

Dùng Marker RM297 định vị trên nhiễm sắc thể số 6, cho đa hình với 6 alen kích thước lần lượt là 183 bp, 175 bp,167 bp, 159 bp, 148 bp