BÁo cáo kết quả ĐỀ TÀi nghiên cứU oOo nghiên cứu chọn giống lúa phẩm chất cao thông qua công nghệ di truyền phục vụ TỈnh hậu giang danh sách những người thực hiện đề tài

• 
  Tùy theo giống: tần số bạch tạng thay đổi tùy thuộc vào giống, có giống ít, có giống nhiều
  
• 
  Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ càng cao thì tỉ lệ cây bạch tạng càng cao
  
• 
  Tuổi mô sẹo cấy chuyền sang môi trường cây tái sinh: nếu dùng mô sẹo già cấy nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh thấp, mất khả năng tái sinh, tỉ lệ bạch tạng tăng
  
• 
  Tăng lượng 2,4 - D cũng là nguyên nhân gây cây bạch tạng
  

Cây con có thể tạo trực tiếp từ phôi đơn tính đực mà không cấy chuyền. Trường hợp cấy phôi cần phải cấy chuyền sang môi trường mới gọi là môi trường tái sinh. Mỗi loại cây sẽ có môi trường tái sinh khác nhau. Thí dụ cây lúa môi trường tái sinh cần lượng đường thấp 20 - 30 gram/lít và 2,4 - D được thay bằng NAA, hoặc IBA. Môi trường cơ bản vẫn MS với 4 mg/lít kinetin và 0,5 mg/lít IAA. Tuy nhiên cũng cho tỉ lệ bạch tạng khá cao. Chú ý tuổi của mô sẹo có ảnh hưởng đến tần suất của cây tái sinh.

3. 
   Chỉ thị phân tử
   

Việc lập bản đồ gen và chọn lọc nhờ marker hình thái như vậy sẽ rất chậm. Số marker quá ít và chỉ có ở qui mô hình thái (cơ quan).

Việc áp dụng isozyme marker đã làm thay đổi theo chiều hướng tốt hơn, nhưng số marker cũng quá ít, không thoả mãn cho nhu cầu nghiên cứu.

DNA marker đã được chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần “isozyme marker” (Tanksley và ctv., 1980). Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và tương lai sẽ rẻ tiền hơn nhờ sự cải tiến không ngừng của các nhà khoa học.

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như là một DNA marker. Các DNA markers có thể được chia thành hai nhóm như sau:

• 
  PCR - based: ALP, AFLP, SSR, SSCP
  
• 
  DNA / DNA hybridization - based: RFLP, minisatellite
  

• 
  MAAP
  
• 
  Marker ngắn, có tính ngẫu nghiên: RAPD, AP-PCR, DAF, AFLP và amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP
  

• 
  Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền
  
• 
  Có nhiều markers trong quần thể
  
• 
  Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển
  

1. 
   RFLP MARKER
   

Trước hết chúng ta phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNA lai. Đó là giai đoạn có tính chất quyết định trong phân tích RFLP. Thí dụ chúng ta cần có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt. Trong quá trình phân lập DNA, người ta phải lấy mô lúa từ trong nhà kính hoặc trên đồng ruộng, mô này được nghiền bằng cối trong nitrogen lỏng. Bởi vì thành tế bào cây lúa rất cứng và rất khó phá vỡ. Nitrogen lỏng làm cho các mô trở nên lạnh và dẽo, như vậy mô có thể được nghiền mịn. Chất đệm khi ly trích DNA có chứa SDS, chất này có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dung dịch. SDS là chất tẩy khá mạnh, nó có thể làm biến đổi protein ở nhiệt độ 65⁰C. Sự biến đổi này làm cho các DNA gắn với protein bị tách rời ra khỏi DNA cần nghiên cứu. Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi DNA bằng phenol/ chloroform hay bằng phương pháp kết tủa chọn lọc của những chất cặn tế bào với potassium acetate. DNA ở pha lỏng sẽ được kết tủa bằng cách thêm vào isopropanal.

Phân lập DNA bằng phương pháp nói trên chỉ áp dụng với DNA có kích thước lớn hơn 30 kb có một ít tạp chất như polysaccharide. Số lượng nhỏ của tạp chất như vậy có thể chưa gây ra vấn đề gì khi phân tích Southern. Nhưng chúng sẽ gây khó khăn khi chạy điện di trên gel, do đó chúng ta phải hết sức thận trọng trong lúc phân lập DNA.

Nguồn gốc của mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA. Mô của cây khoẻ và trẻ cho kết quả phân lập DNA tốt nhất. DNA được phân lập trên mô già hoặc trên loài lúa hoang thường bị tạp do polysaccharide và cho kết quả rất thấp.

DNA được phân lập có thể tồn trữ trong điều kiện -20⁰C. Nhưng chúng ta phải lưu ý rằng, một chút thay đổi nhỏ nào trong quá trình đông lạnh cũng có thể làm phân hủy DNA, tránh đông lạnh nhiều lần, hoặc làm tan băng nhiều lần DNA.

Trong quá trình phân lập, người ta phải sử dụng nhiều dung môi. Có hai dung môi hết sức quan trọng đó là EDTA và Tris.

Tris (Trisma, base) đã được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả trong dung môi. Ở pH 8,.0, DNA rất ổn định. Trong điều kiện môi trường acid, purine rất dễ bị loại thải, tiến trình này được gọi là “depurination” (phản purine hóa). Cầu nối phosphodiester dễ bị phá vỡ, tạo ra kết quả phản purine hóa. Tuy nhiên tính chất này vẫn được sử dụng trong Southern blotting. Do đó, người ta phải kiểm soát pH của dung môi ở mức 8.0 khi dùng Tris.

DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme làm cho các mẫu DNA bị tạp. Chỉ cần chất gây tạp ở thể vệt cũng đủ để gây cho DNA bị hỏng. Enzyme này có thể truyền từ tay của người làm thí nghiệm, hoặc từ không khí, do vậy chúng ta phải rất thận trọng. Để ngăn ngừa khả năng DNA bị thủy phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA. Tất cả các enzyme thủy phân DNA được biết hiện nay đều cần Mg⁺⁺ làm cofactor. EDTA có thể kềm giữ Mg⁺⁺ và làm bất hoạt nó trong dung môi. Không có Mg⁺⁺, enzyme không thể hoạt động.

Có một nhóm enzyme thủy phân DNA được ghi nhận chuyên tính đối với một chuỗi mã DNA nào đó. Nhóm enzyme này được gọi với thuật ngữ là “restriction endonuclease” (enzyme nội sinh, phân cắt hạn chế). Tiến trình thủy phân DNA bằng restriction endonuclease được gọi với thuật ngữ “restriction digestion” (sự tiêu hoá tại điểm xung yếu, có tính chất hạn chế). Để hiểu rõ tại sao người ta phải dùng từ “restriction” trong trường hợp này, chúng ta hãy xem lại khái niệm có tính chất giáo trình về “di truyền thể phage “. Người ta đã tìm ra rất nhiều restriction endonuclease, với hơn 100 enzyme có giá trị kinh tế, mỗi enzyme này có tác dụng chuyên tính với một chuỗi mã di truyền nào đó. Trong hầu hết các trường hợp, đoạn mã di truyền này có tính chất tự tái bản, được cắt theo dạng “palindromic” (5’-3’). Thí dụ, endonuclease EcoRI chỉ phản ứng trên chuỗi DNA tại G/AATTC. Theo tính chất của cấu trúc palindromic tại vị trí mục tiêu để phân cắt, người ta có thể viết một nửa chuỗi mã di truyền DNA, nếu một nửa trước đó, kể từ vị trí cắt đã được biết rồi.

Nhiều đoạn mã được ghi nhận gồm có 6 cặp base [bp] của DNA. Trong một đoạn mã ngẫu nhiên nào đó, tần xuất của vị trí này sẽ là 4096 bp (4⁶). Nhóm enzyme ghi nhận 6 bp DNA được gọi là “6 bp cutter” trong phòng thí nghiệm. Nhóm enzyme khác ghi nhận 4 bp DNA, thí dụ như Alu I sẽ tiêu hoá chuỗi DNA có mang mã AGCT, được gọi là “4 bp cutter”

DNA sẽ được đưa và một bộ sưu tập DNA thống nhất sau khi hoàn tất việc phân cắt các chuỗi mã thành những đoạn phân tử riêng biệt.

Tất cả những đoạn phân tử này sẽ có những phần cuối rất đặc biệt. Các đoạn phân tử sau khi được tiêu hoá bằng Eco I, mang vị trí 5’ ở điểm cuối - còn gọi là “sticky end”. Các sticky end (đầu dính) này có thể tác động qua lại với nhau. Nếu điều kiện cho phép, thí dụ như sự có mặt của ligase và ATP, những đầu dính kết hợp với nhau theo dạng đồng hoá trị, trước khi tiêu hoá.

Điện di trên gel

Độ lớn của các đoạn phân tử sau khi tiêu hoá biến thiên trong khoảng 30 kb, có khi nhỏ hơn 100 bp. Để xác định các đoạn phân tử DNA thông qua kỹ thuật phân tích Southern, người ta điện di các DNA này trên agarose gel.

Agarose là một trong các dạng của polysaccharide. Theo tính chất của nó, các nhà sinh học phân tử đã khai thác đặc tính thể gel trong điện di để phân loại các DNA. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi trong vài phút. Khi nguội lại, những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau [gọi là gelling]. Giữa những hạt như vậy, có những lỗ rất nhỏ. Kích thước của những lỗ này có thể xê dịch chút ít tùy theo nồng độ của agarose gel. Trong điện trường, DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dương, vì DNA mang điện âm (do tính chất của gốc phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch này của DNA. DNA có phân tử càng lớn, thì lực cản càng mạnh. Do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy người ta phân loại được các đoạn phân tử DNA trên agarose gel. Khi thay đổi nồng độ thể gel, kích thước lỗ giữa các hạt agarose cũng thay đổi. Nó sẽ trở nên lớn hơn khi nồng độ gel càng thấp. Khi kích thước lỗ to và phân tử DNA bé, thì sự khuếch tán sẽ gặp trở ngại. Người ta thấy rằng, cần có một sự tương xứng giữa hai yếu tố, để có được kết quả mong muốn trong khi nghiên cứu các đoạn DNA.


MARKER là sản phẩm của PCR (PCR-BASED MARKER)

Phản ứng chuỗi polymersase được viết tắt PCR là tiến bộ kỹ thuật đã được ứng dụng rộng rãi trong những năm đầu của thập niên 1990. Kary Mullis người có công lớn trong phát hiện này, đã được lĩnh giải thưởng Nobel năm 1993

Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction). Đây là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro. Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực thuộc về sinh học.

PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất (denature) của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase.

DNA polymerase là một enzyme có chức năng tổng hợp các dây đơn DNA. Trong điều kiện cho phép nào đó, tiến trình tổng hợp DNA này có thể được sao chép in vitro. Ứng dụng đầu tiên của sinh tổng hợp DNA in vitro gồm có tạo chuỗi mã DNA thông qua phương pháp gây ảnh hưởng đoạn cuối của dây dideoxy của Sanger, phương pháp giải mã DNA đánh dấu, v.v...Tất cả những ứng dụng này đều có trong giai đoạn 1 [chu kỳ 1] của sinh tổng hợp DNA.

Vào năm 1985, một nhóm các nhà khoa học của Cetus Corporation đã tuyên bố có một cách mới trong sinh tổng hợp DNA in vitro, với thành tựu bước đầu về phản ứng chuỗi polymerase có tính chất tự động. Họ đã sử dụng qui trình khuếch đại chuỗi mã di truyền beta globin:

• 
  Tạo dây đơn DNA cần nghiên cứu
  
• 
  Cho các primer tác động DNA cần nghiên cứu
  
• 
  Thêm polymerase để tổng hợp dây đơn bổ sung
  
• 
  Lặp lại bước 1 đến bước 3 với nhiều chu kỳ
  

Sự phát minh ra máy thermalcycler đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp chúng ta có thể thay đổi nhiệt độ định kỳ theo một thời gian nhất định. Chiếc máy có tính chất chương trình hoá này đã hoàn thiện chu kỳ nhiệt một cách tự động và người ta thường gọi nó là máy PCR.

DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Thermus aquaticus, có tính ổn định nhiệt rất cao. Một nửa chu kỳ của Taq polymerase được giữ ở nhiệt độ 94⁰C trong vòng 40 phút. Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ cao trong sinh tổng hợp DNA [70 - 72⁰C]. Ở quãng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể cao như 150 nucleotides / giây / enzyme. Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở quãng nhiệt độ 70 - 72⁰C trong vòng một phút. Từ đó hàng kilo base của các đoạn DNA có thể được tổng hợp.

Taq polymerase nhạy cảm với ion magnesium. Nồng độ tối hảo của Mg⁺⁺ là 1,5 – 2,5 mM. Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg⁺⁺, cho nên nồng độ chính xác của magnesium tùy thuộc vào nồng độ của dNTP. Các thành phần khác ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris.

Chất đệm:

• 
  Tris (pH 8,4) 10 mM
  
• 
  KCl 50 mM
  
• 
  MgCl₂ 1,5 - 2,0 mM
  

Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một cặp mồi (primer). Sự khuếch đại chuyên biệt nào đối với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tùy thuộc các primer tương xứng. Cả hai yếu tố: chiều dài primer và thành phần G + C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn.

Người ta mua các nucleotides ở các công ty hoá chất, có chất lượng tốt. Nếu nó được bảo quản ở dạng bột đông khô [freeze - dried powder]. Sau đó người ta phải điều chỉnh lại độ pH, trước khi sử dụng.

Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước, được gọi với thuật ngữ “target DNA” (DNA mục tiêu) trong kỹ thuật PCR. Người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ mô lá. Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 - 10 ng DNA thuần khiết, đủ để cho những kết quả theo mong muốn. Người ta cần có ethanol trong lần cuối của qui trình chuẩn bị DNA. Với 10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polymerase.

Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE trong khi sử dụng để hoà tan DNA. EDTA sẽ gắn với Mg⁺⁺, sao cho thể tích của DNA mục tiêu không vượt quá 1/5 của thể tích PCR

Phát hiện DNA có tính đa hình nhờ PCR

Sản phẩm của PCR là những đoạn mã DNA. Khi DNA xuất phát từ hai dòng lai với nhau được khuếch đại lên nhờ các primer tại locus đặc biệt nào đó, thì trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR này có thể rất khác nhau, vì có những thay đổi vật lý trên chuỗi mã DNA, nghĩa là, sự mất đoạn hay thêm đoạn DNA sẽ xảy ra trong vùng bị khuếch đại này. Thể đa hình được gọi là “amplicon length polymorphism” [ALP] phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể / các dòng lai / các giống lúa. Thuận lợi của ALP so với RFLP trong việc phát hiện này là: (1) nó rất nhanh, chỉ cần một ngày giúp ta tìm ra kết quả, (2) không có chất đồng vị, (3) rẻ tiền, (4) cần rất ít DNA. Bất lợi của ALP là người ta phải biết rõ chuỗi mã DNA đầu tiên khi tổng hợp primer.

2. 
   RAPD marker
   

3. 
   SSCP marker
   

Người ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chưa qua quá trình biến hoá DNA thành dây đơn (denaturation). Người ta giả định rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single - strand conformation). Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình.

Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành. Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa. Người ta ngâm các mẫu này trong nước đá. Bấy giờ hiện tượng “snap - back” sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp. Để tránh hiện tượng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu này phải được xử lý trong điều kiện lạnh. Nếu P³² được dùng trong PCR, thì phim chụp X quang sẽ thể hiện rõ trên gel. Nếu không, người ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel. Nhuộm bạc trên DNA dây đơn (SS DNA) sẽ nhạy cảm gấp trăm lần hơn nhuộm ethidium bromide.

4. 
   STS marker
   

Kỹ thuật DNA marker trên cơ sở vị trí được đánh dấu có tính chất mã di truyền: ”STS” viết tắt từ chữ sequence - tagged sites, là một cách để khắc phục trở ngại nói trên.

Khái niệm STS do Olson và ctv. (1989) đề xuất. Trong khi đánh giá hiệu quả PCR trên lĩnh vực nghiên cứu genome con người, họ ghi nhận những chuỗi mã DNA dạng bản sao (copy) đơn của một vị trí đã biết rồi trên bản đồ, có thể được xem như một marker để lập bản đồ di truyền và bản đồ vật lý các gen quan trọng trong các nhiễm sắc thể.

Thay vì bảo quản, duy trì vật liệu sinh học, các nhà khoa học bảo quản các thông tin có tính chất điện tử [electronic information] vì nó dễ nhận ra, sắp xếp theo thứ tự và lan truyền. Những marker được lưu trữ có tính chất điện tử này đã được gọi là STS. Ứng dụng STS để phát triển các bản đồ vật lý từ những bản đồ di truyền, đang được tiến hành trong nhiều chương trình nghiên cứu, kể cả cây lúa (Inoue và ctv., 1994).

Một STS là một đoạn ngắn của chuỗi mã di truyền, được tìm thấy bởi PCR (Saiki và ctv., 1985). Mỗi STS được ghi nhận trên bản đồ, tại một vị trí chuyên biệt nào đó như là một ranh giới (landmark) trong genome. Do vậy người ta còn dùng thuật ngữ “standard landmarkers” để chỉ STS marker. Kỹ thuật PCR có vẻ thích hợp hơn kỹ thuật DNA blotting trong chọn lọc giống nhờ marker (MAS). Nó yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng thấp hơn DNA blotting. Do đó, qui trình ly trích DNA có thể được cải tiến đơn giản hơn, mà vẫn tránh được hiện tượng mẫu lớn. Nó còn có tính tự động hóa rất cao, không phải sử dụng phóng xạ, hay yêu cầu các hệ thống tìm kiếm có tính chất hóa sinh phức tạp (Zheng và ctv., 1995). STS - based PCR có ưu điểm là một bộ phận giản đơn, có tính sinh sản nhanh trên gel: agarose hoặc polyacrylamide. Bộ phận này dễ nhận thấy và dễ diễn giải, trong hầu hết các trường hợp nó là “codominant”. Những marker như vậy cho phép thể dị hợp có thể được phân biệt với hai thể đồng hợp.

Biến thiên di truyền giữa hai giống lúa có thể được phân tích nhờ khác biệt về độ dài của đoạn DNA đặc biệt nào đó thông qua kỹ thuật PCR, với cùng một cặp mồi. Vì sản phẩm của PCR được gọi là sản phẩm khuếch đại (amplicon) cho nên biến thiên như vậy được gọi là amplicon length polymorphism (ALP). Khi không có ALP nào được phát hiện bởi một cặp mồi giữa hai giống, người ta áp dụng kỹ thuật PCR - based RFLP (viết tắt là PBR) với một enzym cắt hạn chế (restriction enzyme) nào đó, cho thêm vào để tiêu hoá amplicon này. Việc xác định enzyme này cần làm với hàng loạt xét nghiệm, cho đến khi nào tìm được đa hình xảy ra trên điện di.

Trước đó cặp primer (F và R) được thiết kế sau khi chạy sequence RFLP marker cần thiết. Việc thiết kế này tùy thuộc vào kinh nghiệm và kỹ năng của người làm việc trong phòng thí nghiệm.

Cả hai ALP và PBR đều được xem như là PCR - based marker

5. 
   Microsatellite marker
   

6. 
   AFLP marker