AFLP là chữ viết tắt của Amplified Restriction Fragment Length Polymorphism. Nó được áp dụng cho kỹ thuật DNA fingerprinting

Kỹ thuật DNA fingerprinting đã và đang được phát triển khá thành công với hai hướng chiến lược nghiên cứu như sau:

• 
  Fringerprinting trên cơ sở lai, có tính chất kinh điển: bao gồm kỹ thuật cắt DNA bằng restriction endonuclease tương ứng, kỹ thuật điện di, RFLP được phát hiện bởi kỹ thuật lai với mẫu dò (probe) thông qua xét nghiệm Southern.
  
• 
  Fingerprinting trên cơ sở PCR: bao gồm kỹ thuật khuếch đại DNA in vitro bằng primer đặc biệt hay primer ngẫu nhiên, kỹ thuật polymerase trong máy thermalcycler. Sản phẩm PCR được phân biệt nhờ điện di trên gel, được phát hiện nhờ phương pháp nhuộm hoặc phương pháp đánh dấu primer. Kỹ thuật đã được sử dụng theo chiến lược này là RAPD, DAF, AP - PCR.
  

Thành công của kỹ thuật AFLP tùy thuộc vào phản ứng của enzyme tiêu hoá có trọn vẹn hay không? Do đó, chúng ta phải thận trọng trong việc phân lập DNA có chất lượng cao, không làm tạp nuclease hoặc ức chế nó.

Số lượng C và G trong các nucleotide có tính chọn lọc sẽ rất quan trọng quyết định số đoạn phân tử được khuếch đại. Thông thường, càng nhiều C và G có trong primer thì các đoạn phân tử DNA được khuếch đại càng ít. Tương tự như vậy, nếu kích thước genome càng nhỏ, số đoạn phân tử được khuếch đại sẽ càng ít và fingerprint càng đơn giản hơn rất nhiều.

Protocol đầu tiên cho kỹ thuật AFLP do Zabeau và Vos (1993) nhấn mạnh đến sự quan trọng của việc làm thuần khiết hai enzyme sử dụng, sau đó là chuẩn bị adapter và thiết kế primer một cách thận trọng. Ngày nay nó đã được cải tiến khá nhiều với những công dụng như sau:

• 
  Công cụ có hiệu quả phát hiện tính chất đa hình
  
• 
  Xây dựng bản đồ di truyền có mật độ cao của genome
  
• 
  Xây dựng bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác khám phá ra những clone của genome, thí dụ YAC
  
• 
  Fingerprinting các đoạn DNA đã được “cloned” như cosmid, P1, BAC, YAC
  

7. 
   Xây dựng bản đồ nhờ marker phân tử
   

Ngày nay việc lập bản đồ di truyền của cây lúa trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ phương tiện DNA marker. Đầu tiên bản đồ di truyền trên cây lúa được thiết lập nhờ kỹ thuật RFLP (Mc Couch và ctv., 1988; Kutara và ctv., 1994; Tanksley S.D và ctv., 1990), sau vài năm bản đồ được thiết kế với nhiều marker hơn (Causse và ctv., 1994).

Kỹ thuật PCR ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta tiến hành ứng dụng đánh dấu phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn (Williams và ctv.,1990). Phương pháp PCR tách được các markers trong nhóm các chuỗi trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeats - SSR) trên cơ sở điện di. Trong những năm gần đây người ta có khuynh hướng dùng microsatellite hay còn gọi là đoạn phân tử lặp lại có chuỗi mã đơn giản SSR vì những đặc tính ưu việt của nó so với các phương pháp khác.

Microsatellite là một PCR - based marker khám phá sự khác biệt các “vệ tinh” (microsatellite) bằng cách nhân bản các chuỗi mã đơn giản lặp lại phân tán trong genome sinh vật nhờ phản ứng PCR. Các đoạn ADN này sau đó được tách ra trên gel polyacryramide hoặc agarose và hiển thị nhờ phản ứng nhuộm Bạc (Ag) hoặc Ethydium Bromide rồi chụp hình bằng tia UV. Chiều dài các đoạn ADN trên điện di thường khoảng 100 - 200 bp. Các đoạn mồi (primer) được thiết kế cho phản ứng PCR dựa trên chuỗi mã ở hai đầu của các “vệ tinh”. Thể đa hình chiều dài các chuỗi mã đơn giản lặp lại (SSLPs) được xác định dựa trên sự khác biệt về số lượng các đơn vị lặp lại tại locus mà marker đó định vị (Jacob và ctv., 1991; Litt và Luty, 1989; Weber và May, 1989; Zheng K và ctv., 1995) và nó cung cấp một nguồn đánh dấu sự khác biệt ngay trên vật chất di truyền.

SSR rất phong phú và phân bố rộng trong genome cây lúa vì thế chúng được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các giống lúa (McCouch và ctv., 1997). Bản đồ di truyền SSR trên genome cây lúa được thiết kế với các SSR markers được viết tắt là RM (Rice Microsatellite) ở Mỹ và OSR ở Nhật. Sự phong phú về số lượng các marker SSR với các motif lặp lại phát triển trên những phần mã hóa và không mã hóa của genome cây lúa (Wu và Tanksley, 1993; Panaud và ctv., 1995,1996; Akagi và ctv., 1996; Chen và ctv., 1997; Temnykh và ctv., 2000) giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và khác biệt các chuỗi mã đơn giản lặp lại trên toàn bộ genome ngày càng hoàn hảo. So sánh 323 SSR markers (194 markers từ kho lưu trữ genomic của cây lúa và 129 markers từ kho lưu trữ thiết lập từ protein (isozyme marker) thể hiện các tính trạng rice - expressed sequence tags - ESTs), Cho và ctv. (2000) xác định tỉ lệ đa hình tìm thấy nhờ các marker từ genome cao hơn rất nhiều các marker từ ESTs (83,.8% so với 54,.0%). Về các motif lặp lại, mức độ đa dạng di truyền cao nhất tìm thấy ở marker khuếch đại chuỗi mã GA trong khi hầu hết các marker khuếch đại chuỗi mã CCG hoặc CAG không tìm thấy sự khác biệt. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cần phải cải tiến để có những marker cung cấp ở mức độ cao hơn tính đa dạng alen, dùng trong thẩm định quỹ gen.

SSR là marker có giá trị cao bởi vì chúng thường là dạng di truyền co-dominant và dễ dàng phân tích bằng PCR. Trên lúa có khoảng 5.700 – 10.000 SSR có trình tự khác nhau 2, 3, hoặc 4 đơn vị lặp lại. Với số lượng lớn SSR sẽ rất thuận lợi cho việc ứng dụng lập bản đồ gen. Một bản đồ gen của cây lúa được Chen và ctv. (1997) thiết lập trên 121 SSR marker. Một bản đồ có mật độ phân tử cao cũng đã được công bố năm 1998. Bản đồ này được thiết lập với 2.275 marker bao phủ 1521.6 cM dựa trên quần thể gồm 186 cá thể con lai F₂ từ tổ hợp lai giữa Nipponbare (Japonica) và Kasalath (Indica) (Harushima và ctv., 1998). Một bản đồ khác đã được thực hiện bằng 312 SSR marker phủ đầy genome với mức độ bao phủ trung bình của một marker là 6 cM (Temnykh và ctv., 2000). Ngoài ra McCouch và cộng tác viên (2002) cũng đã phát triển và thiết lập bản đồ trên cây lúa với 2240 SSR marker mới.

Nguyễn Thị Lang (2001) đã thiết lập bản đồ di truyền cho gen kháng mặn trên cây lúa bằng SSR marker trên các quần thể con lai BC₂F₂ của nhiều tổ hợp lai khác nhau. Đối với quần thể con lai giữa IR64/ Chenghui bản đồ được thiết lập với 34 SSR marker có tổng chiều dài là 148,6 cM phủ trên 3 nhiễm sắc thể số 1, 8, 9. Quần thể con lai giữa IR 64/ OM 1706 có 35 SSR marker được sử dụng để xây dựng bản đồ, có tổng chiều dài 50,5 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 1 với 8 marker. Có 47 marker được sử dụng trong phân tích quần thể con lai của tổ hợp IR 64/FR 13A, các marker này có tổng chiều dài 191,6 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 1 và 109,3 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 11. Quần thể con lai của tổ hợp Tequing/ OM 1706 sử dụng 28 SSR marker với tổng chiều dài 95,4 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 6. Tác giả cũng đã sử dụng 40 SSR marker để thiết lập bản đồ di truyền trên quần thể con lai giữa IR 68552 - 55 - 3 - 2/ Chenghui 448 với tổng chiểu dài 253,1 cM được phủ trên nhiễm sắc thể số 1 và số 9. Bản đồ di truyền cho gen kháng mặn được nghiên cứu trên quần thể IR 28 lai với Đốc phụng (Lang và ctv., 2001)

Các tổ hợp lai giữa lúa trồng và lúa hoang đã được phân nhóm di truyền thông qua STS marker trên gen kháng rầy nâu Bph - 10 và SSR marker để phát hiện gen mục tiêu du nhập từ lúa hoang vào lúa thường các tính trạng chống chịu độ độc nhôm, chống chịu sâu bệnh chính, năng suất cao… (Lang và Bửu, 2002a). Marker STS và SSR khẳng định gen kháng bạc lá Xa-13 cũng được thiết lập trên quần thể BC2F2 giữa lúa mùa và lúa cải tiến (Nguyễn Thị Pha, 2003), đặc tính di truyền kháng bệnh bạc lá cũng được phân tích và thiết kế các cặp mồi tương ứng trên cơ sở chuỗi ký tự của primer RG140 để phát hiện các gen kháng Xa - 21, Xa - 13, Xa - 5 (Lang và Bửu, 2002c).

Cũng với kỹ thuật microsatellite marker, bản đồ gen mùi thơm được xây dựng nhờ marker RG28F - R liên kết trên nhiễm sắc thể số 8 thông qua phân tích BC1F1, F1, F2, BC1F2 các tổ hợp lai IR 64/ Jasmine, IR 64/ DS 20 (Lang và ctv., 2002b, 2004).

Bản đồ di truyền trên gen độ trở hồ:

Độ trở hồ do gen alk và qASS - 6. Một vài nghiên cứu cho thấy độ trở hồ có liên quan đến hàm lượng amylose. Gen alk và qASS - 6 có sự liên kết với gen Wx (McKenzie và Rutger, 1983) và thực tế về kiểu hình thì độ trở hồ quyết định rất lớn đến hàm lượng amylose (Jennings và ctv., 1979).

He và ctv. (1999) thiết lập bản đồ di truyền quần thể tế bào đơn bội kép (double haploid) dùng cây lai F1 ZY Q8 (O.indica) và JX 17 (O.japonica) (Lu và ctv., 1996; He và ctv., 1998) để nghiên cứu hệ di truyền độ trở hồ và tìm thấy cả gen chính và gen phụ của độ trở hồ đều nằm trên nhiễm sắc thể số 6, marker CT201-RZ450. Độ trở hồ kiểm soát bởi 2 gen alk và qASS - 6, trong đó alk là gen kiểm soát giá trị làm nhoè hạt gạo bằng chất kiềm (alkali).

Bản đồ di truyền trên hàm lượng protein

Hệ di truyền hàm lượng protein do đa gen kiểm soát phân bố trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 6, 9, 12 (các thành phần của glutelin), nhiễm sắc thể 7, 11 (protein dự trữ trong nội nhũ), nhiễm sắc thể 5, 7, 12 (các thành phần của prolamin) (theo http://www.ricegenome.org/). Theo Nguyễn Thị Lang (2004), hàm lượng protein biến động mạnh mẽ do tác động của môi trường, qua nhiều năm nghiên cứu cho thấy hệ số tương quan với môi trường từ 0,130 tới 0,372 tương tác kiểu gen và môi trường (G x E). Kết quả nghiên cứu của Shenoy và ctv. (1991) chứng tỏ rằng, hệ di truyền hàm lượng protein khoản 71%. Một số cặp lai nghiên cứu thì hàm lượng protein rất thấp từ 11,1% (Lang và Bửu, 2004).Từ những biến động trên cần phải phân nhóm di truyền trên các nhóm khác nhau của các giống lúa địa phương, xem như là vật liệu lai tốt phục vụ cho chương trình chọn giống lúa tốt hơn. Tuy nhiên khi đánh giá kiểu hình tính trạng protein cũng sẽ ảnh hưởng với môi trường rất lớn, do đó kết hợp với marker phân tử để đánh giá và phân nhóm sự liên quan với các giống.

3. 
   VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
   
   1. 
      Vật liệu
      
      1. 
         Nhóm lúa thực hiện qua hai vụ: Hè Thu và Đông Xuân
         

Bảng 6: Các dòng có triển vọng, dùng đánh giá để chuẩn bị đưa sản xuất

2. 
   Các dòng phục vụ cho nuôi cấy túi phấn
   

Bảng 7: Một số đặc điểm các giống trong tổ hợp lai

2. 
   Địa điểm
   

Bảng 8: Danh sách nông dân thực hiện khảo nghiệm so sánh năng suất giống lúa có triển vọng tại các điểm tỉnh Hậu Giang vụ Hè Thu 2006