MỞ ĐẦu lý do chọn đề tài

1.3 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam

Ở đồng bằng sông Hồng trong mùa khô, sự xâm nhập mặn trở nên phổ biến đã ảnh hưởng xấu đến sản xuất nông nghiệp, làm trở ngại cho nuôi trồng thủy hải sản. Các con sông bị xâm nhập mặn hàng năm là rất lớn (bảng 1.4)

Các vùng lúa nhiễm mặn ở ĐBSH thuộc các tỉnh: Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa. Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000 ha ở cả hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ 0,3-0,5%, chủ yếu tập trung tạo các huyện: Kiến Thuỵ, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vĩnh Bảo. Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương. Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000 ha chủ yếu ở các huyện Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy. Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đất nhiễm mặn ở các huyện Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung. riêng huyện Hậu Lộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005 [3].

Bảng 1.4. Tình hình xâm nhập mặn một số con sông ở châu thổ sông Hồng

Tên sông	0,1 L max.(km)*	0,1 L min.(km)	0,4 L max.(km)
- Kinh Thầy - Lạch trà - Vân úc - Thái Bình - Trà Lý - Sông Hồng - Ninh Cơ - Sông Đáy	40 30 28 22 20 14 32 40	27 22 18 15 8 10 11 15	12 12 8 6 3 2 10 10

* 0,1%; 0,4% = độ mặn; Lmax = chiều dài xâm nhập tối đa;

Lmin = Chiều dài xâm nhập tối thiểu

Dọc theo ven biển các tỉnh miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như Hà Tĩnh có khoảng 17.919 ha, Quảng Bình có hơn 9.300 ha bị nhiễm mặn và Ninh Thuận có gần 2.300 ha đất bị nhiễm mặn.

Diện tích tự nhiên khoảng 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, đồng bằng sông Cửu Long giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Đây là vùng đất có ưu thế lớn về nông nghiệp với diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng 2,9 triệu ha (sản lượng lương thực chiếm 50% tổng sản lượng lương thực của cả nước) [1]. Theo Trần Thanh Cảnh (1998), vùng ĐBSCL có các nhóm đất chính sau: (1) Đất phù sa có diện tích khoảng 1.180.000 ha, chiếm 30,1% diện tích toàn vùng; (2) Đất phèn mặn có diện tích khoảng 1.600.000 ha, ước tính 40,7% diện tích toàn vùng; (3) Đất mặn có diện tích là 744.000 ha, chiếm 18,9%, có độ phì tự nhiên cao nhưng bị nhiễm mặn nên việc tăng vụ, tăng năng suất trong sản xuất bị hạn chế; (4) Đất xám có diện tích khoảng 134.656 ha, chiếm 3,4% bao gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xám đọng mùn gley trên phù sa cổ. Toàn bộ diện tích tự nhiên của 8 tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long là 2,86 triệu ha, trong đó được phân bố ra 4 loại đất: phù sa cổ, phù sa mới, đất mặt acid và đất mặn (hình 1.2)

Do ảnh hưởng của thủy triều, nước mặn từ biển thường tràn vào sâu trong đất liền vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít tùy thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng vùng. Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện trùng với kỳ triều cường trong tháng, nước biển mặn vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và có ít nước thượng nguồn đổ về. Do vậy, mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm nhập của nước biển và tùy vào mùa trong năm. Cao điểm vào các tháng có lượng mưa thấp, khoảng tháng 3-4 dương lịch [12].

Đối với cây lúa, tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây [28]. Tính trạng bất thụ của bông lúa khi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này không tiếp tục thể hiện ở các thế hệ sau. Phân tích diallel về tính trạng chống chịu mặn, người ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính với hệ số di truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn [54].

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn [25].

Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chống chịu mặn ở giai đoạn trưởng thành của cây lúa. Hầu hết các thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạ với quy mô quần thể hạn chế và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị [28,44]. Cây lúa nhiễm mặn có xu hướng hấp thu Na nhiều hơn cây chống chịu. Ngược lại, cây chống chịu mặn hấp thu K nhiều hơn cây nhiễm. Ngưỡng chống chịu NaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m [44]. Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng tế bào. Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của nhóm glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh hưởng gây hại của mặn. Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+ và hạn chế hấp thu Na+ [45].

Ảnh hưởng của mặn đến hoạt động sinh trưởng và phát triển của cây lúa, ở từng giai đoạn khác nhau thì mức độ thiệt hại khác nhau [54]. Nhưng việc khám phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được. Do đó, để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của cây lúa phải chia ra nhiều giai đoạn về sự sinh trưởng và phát triển. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu [45].

Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích lũy quá nhiều ion Cl^- [44]. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng nguyên nhân gây tổn hại cho cây lúa trong môi trường mặn là do tích lũy qúa nhiều ion Na⁺, ion này trực tiếp gây độc trên cây.

Ion Na⁺ có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây. Ion K⁺ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn của cây. Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Do vậy, cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na⁺ và gia tăng hấp thu K⁺ để duy trì sự cân bằng Na^-K trong chồi [53].

Theo Gregorio và cs, mặn gây hại trên cây lúa bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kế tiếp và cứ thế tiếp diễn. Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy trì sự sống và xanh. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá. Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại [30].

Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt giai đoạn nẩy mầm lại trở nên rất nhiễm trong giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), sau đó chống chịu trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, rồi lại nhiễm trong suốt giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [50,56]. Theo một nghiên cứu khác của Aslam và cs (1993), thấy rằng tại giai đoạn trổ bông cây lúa không mẫn cảm với mặn [16].

Theo Yeo và Flowers (1984) [66], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quan đến tính chống chịu mặn được tóm tắt như sau:

- Cây lúa không hấp thu (hoặc hạn chế ở mức rất thấp) lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc.

- Cây lúa hấp thu lượng muối thừa nhưng tái hấp thu lại trong mô libe, do đó Na⁺ không di chuyển đến chồi thân.

- Sự vận chuyển của Na⁺ từ rễ đến chồi là rất thấp.

- Lượng muỗi hấp thu thừa sẽ được vận chuyển đến các lá già và được giữ lại tại đó.

- Tăng tính chống chịu của cây lúa do lượng muối hấp thu dư thừa sẽ được giữ lại tại các không bào, làm giảm mức gây hại đến quá trình sinh trưởng của cây lúa.

- Cây làm loãng nồng độ muối dư thừa nhờ tăng tốc độ sinh trưởng và gia tăng hàm lượng nước trong chồi.

Tất cả những cơ chế trên đều nhằm hạ thấp nồng độ Na⁺ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na⁺/K⁺ trong chồi (<1).

Theo Yeo và Flowers, hầu hết tất cả các giống lúa đều bị ảnh hưởng rõ rệt ở nồng độ 50 mol NaCl/m3 trong giai đoạn mạ (14 ngày), thời gian làm cho 50% số cá thể chết tại nồng độ mặn này thay đổi từ 9 đến 60 ngày tùy theo giống lúa. Vì vậy, môi trường có nồng độ 50 mol NaCl/m3 dung dịch được xem như một môi trường hữu dụng để thanh lọc mặn cây lúa [66].

Ở cây lúa, hàm lượng muối đi vào chồi được điều chỉnh rất thấp. Điều này có thể là do sự hấp thu chọn lọc rất hiệu quả đối với K⁺. Một khả năng khác là ion Na⁺ được hấp thu với hàm lượng lớn nhưng lại được hấp thu lại trong nhựa xylem trong những phần của đầu rễ hoặc chồi và sau đó được dự trữ hoặc được chuyển trở lại đất [66]. Theo Aslam và cs (1993), khi cây lúa được đặt trong dung dịch NaCl, hàm lượng sodium, calcium, kẽm, phosphorus và chloride đều gia tăng, trong khi hàm lượng potasium và magnesium đều giảm trong nhựa của chồi. Khả năng chống chịu mặn của các giống lúa cao hay thấp có quan hệ với hiệu quả ngăn chặn Na⁺ và Cl^- vào cây. So sánh khả năng hấp thu lựa chọn K⁺ cho thấy rằng, đã có sự khác nhau lớn giữa các giống lúa về khả năng hấp thu chọn lọc K⁺ trong môi trường.

Theo Zhu (2001), ion K⁺ tham gia làm tăng hoạt hóa một số enzyme ở tế bào thực vật và tỷ lệ “Na⁺/K⁺” thấp hay đúng hơn là hàm lượng K+ trong dung dịch của chồi lúa xác định tính chống chịu mặn của những dòng lúa khác nhau [47]. Người ta còn thấy vai trò của kẽm (Zn) trong chồi có liên quan đến tính chống chịu mặn của cây lúa khi hàm lượng Zn trong chồi của giống NIAB6 cao, tính chống chịu mặn cao. Muhammad và cs (1987) cũng đã chứng minh rằng, ở giống chống chịu mặn KS282, nồng độ của Zn cao hơn so với dòng nhiễm IR28. Vai trò của Zn khi tham gia vào tính chống chịu mặn có thể là do nó làm gia tăng hàm lượng N trong chồi. [44]. Điều này dẫn tới việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn. Như vậy, có sự liên quan giữa tính chống chịu mặn của cây với sự ngăn chặn hiệu quả các ion Na⁺, Cl^- đồng thời, hấp thu ưu tiên và có chọn lựa các ion K⁺ và Zn²⁺ để có tỷ lệ K⁺/Na⁺ và Zn/P phù hợp [16].

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các giống lúa chống chịu mặn sẽ duy trì nồng độ Na⁺ và Cl^- thấp, nồng độ của K⁺ và Zn²⁺ cao hơn và tỷ lệ Na⁺/K⁺ thấp trong mầm lúa. Kết quả phân tích trên một số giống lúa chịu mặn như Pokkali, SR26B và giống nhiễm mặn điển hình như IR28, IR29 cho thấy: tỷ lệ Na⁺/K⁺ trong giống pokkali rất thấp (0,397) và giống SR26B (0,452) trong khi đó rất cao ở IR28 (0,652) và IR29 (0,835) [53].

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn EC = 12 dS/m, các yếu tố môi trường được kiểm soát trong 19 ngày. Kết quả cho thấy, sự tăng khả năng hấp thu K⁺ là duy trì tốt tỷ lệ cân bằng Na⁺/K⁺ trong chồi. Tỷ lệ này được kiểm soát bởi hiệu quả gen cộng và gen trội. Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa số lượng muối được đi vào rễ cây với nồng độ muối trên chồi. Sự tương quan này đã được xác định bởi mối quan hệ giữa tốc độ sinh trưởng của chồi với sự di chuyển thực của những ion ngoài rễ. Giá trị này là số lượng thực của những ion được di chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian.

Quan sát kiểu chết của lá lúa trong điều kiện nhiễm mặn cho chúng ta thấy rằng, có sự khác nhau về hàm lượng Na⁺ trong những lá khác nhau, tại bất cứ thời gian nào. Những lá già bị chết trong khi những lá non hơn vẫn giữ màu xanh và sinh trưởng. Đây là đặc điểm đặc trưng nhất trong cơ chế chống chịu mặn ở họ hòa thảo. Cây lúa là một tập hợp gồm lá cây, đốt, bộ rễ, những nhánh có khả năng sống độc lập được tách ra. Dạng sinh trưởng này giúp cây một lá mầm tự hủy những phần, bộ phận của cây dễ dàng hơn so với những cây hai lá mầm. Vì vậy, rụng lá là một hiện tượng thông thường ở những cây một lá mầm có khả năng chống chịu mặn. Do đó, khi phân tích trên những lá lúa sống trong môi trường mặn cho thấy rằng: có sự chênh lệch hàm lượng muối từ lá này tới lá khác, muối luôn được tích lũy với nồng độ cao trong những lá già và hiện tượng chết của những lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cơ thể. Tất cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ Na⁺ trong các mô chức năng, do đó giảm tỷ lệ Na⁺/K⁺ trong chồi. Tỷ lệ Na⁺/K⁺ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa chống chịu mặn. Mỗi một giống lúa đều có một hoặc hai cơ chế chống chịu mặn nêu trên. Phản ứng của cây trồng đối với môi trường mặn rất phức tạp, là tổng hợp của nhiều yếu tố riêng lẻ [66].

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng: yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn [25].

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12 dS/m) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy rằng, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của một nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp [61].

Theo Mishra và cs (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng chiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính [42].

Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất thấp trong các tính trạng. Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ Gregorio và Senadhira (1993) cho rằng: có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai. Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năng suất thể hiện hoạt động của một nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn. Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Trong một số giống lúa, ưu thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống cho môi trường mặn [30].

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs (1996) cho rằng, chiều dài bông và khối lượng hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này sẽ không hiệu quả. Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn. Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn [42]. Thêm nữa, theo nghiên cứu của Narayanan và cs. (1990), số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn [46].

Bản đồ QTL (Quantitative Trait loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu mặn, hạn, lạnh, ...). Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong hệ gen cây trồng có thể cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác.

Teng (1994) đã sử dụng quần thể cận giao tái tổ hợp (RI) thế hệ F8 bao gồm 324 cá thể thuộc tổ hợp lai giữa IR29/Nona Broka để nghiên cứu di truyền tính chống chịu mặn của cây lúa. Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều kiện EC = 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng. Phân tích RFLP với 5 enzyme phân cắt hạn chế (DraI, EcoRV, HindIII, ScaI, XbaI) cho thấy trong 266 RFLP marker, có 117 RFLP marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa với mật độ 15 cM/quãng. RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất. Có13 marker định vị gần RG100 và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử dụng để xem xét liên kết gen. Phân tích ANOVA một chiều chứng minh Nona Broka mang allele (allele) kháng liên kết với RG100 và RZ323 tại các loci số lượng. Khi phân tích ANOVA hai chiều, tác giả phát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8) liên kết với QTL chống chịu mặn. Các cá thể tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ở locus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333 có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môi trường mặn so với những tổ hợp khác [61].

Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol). Bên cạnh gen chủ lực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp. Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 10 và 12 [14, 23, 33].

Kawasaki và cs (2001) đã sử dụng kĩ thuật microarray để theo dõi sự thể hiện của phân tử transcript và từng quá trình thể hiện gen điều khiển tính chống chịu mặn trong cây lúa. Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker EST của hệ gen cây lúa chống chịu mặn pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật microarray để kiểm soát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức không xử lý mặn, thời gian thay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây mặn nhân tạo. Vật liệu được sử dụng là giống lúa pokkali (chuẩn kháng) và giống IR29 (chuẩn nhiễm). Nhóm tác giả này tập trung xem xét phản ứng đối với stress do mặn trong quần thể lai có 1782 transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý mặn (NaCl ở nồng độ 150mM). Kết quả này cho thấy một tiến trình điều tiết gen chức năng với nhiều mức đồ khác nhau của transcript. Trong giai đoạn đầu tiên, đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali. Sau 3-6 giờ xử lý mặn, mức độ phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, còn IR29 có sự suy giảm trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó [22].

1.5. Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong nghiên cứu, xác định gen chống chịu mặn.

1.5.1. Chỉ thị phân tử SSR

Simple sequence repeat (SSR) là một trong những chỉ thị phân tử quan trọng nhất. SSR marker được sử dụng rộng rãi trong dấu chuẩn phân tử ADN, lập bản đồ, MAS, và trong những nghiên cứu về đá dạng di truyền và di truyền quần thể. SSR hay microsatelites (các vi vệ tinh) là trình tự ADN lặp tồn tại trong hệ gen sinh vật, có chiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên. Mỗi đơn vị lặp thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotit (có tài liệu nói đoạn lặp có thể có từ 1-6 nucleotit) [61]. Số lần lặp lại của mỗi đơn vị có thể từ 10 đến 100 lần. Ở lúa người ta đã phát hiện ra các kiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT.

Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu rất đặc trưng. Bởi vậy trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại được sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR. Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại mà kỹ thuật này rất phù hợp trong nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. Cũng giống như kỹ thuật RADP, kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém. Mặt khác, SSR là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện các cá thể dị hợp tử, và lập bản đồ gen khi sử dụng quần thể F2 [5].

1.5.2. Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn

Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu stress mặn dựa trên kiểu hình rất khó do có sự tương tác giữa các gen. Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen chống chịu mặn, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn.

Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen kháng trong quần thể phân li. Độ chính xác của phương pháp này có thể lớn hơn 99,75% khi gen kháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từ chỉ thị phân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM. Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen kháng khác nhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình [68].

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyền hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,…. Tuy nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp.

Trong số các chỉ thị phân tử, thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế.

Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40-65% tính chống chịu mặn của lúa [26, 47].

Lang và cs (2001) đã sử dụng 74 chỉ thị RFLP kết hợp với 91 cặp mồi SSR trên quần thể RIL F8 của tổ hợp lai Tenasai 2 / CB và đã lập được bản đồ QTL của một số tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện tượng chống chịu mặn ở cây lúa (Hình 1.4) [3].

Bùi Chí Bửu và cs (2000) đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng. Các tác giả đã xác định 10 SSR marker cho đa hình của các sản phẩm PCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ. Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8. RM223 nhân bản đoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 [3]. Nguyễn Thị Lang và cs (2001) báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 [3].