MỞ ĐẦu lý do chọn đề tài
Chọn tạo giống lúa chịu mặn
tải về 2.41 Mb.
|
1.6. Chọn tạo giống lúa chịu mặn 1.6.1. Chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới Các quốc gia trên thế giới, đã và đang tiến hành chọn tạo và canh tác có hiệu quả một số giống lúa chịu mặn. Nhiều nguồn giống lúa mùa địa phương như Nona Broka, Burarata chống chịu tốt với điều kiện mặn tương đương với giống Pokkali đã được xác định. Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt, kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn. Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), từ năm 1977-1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3. Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm. Những giống lúa cải tiến này cho năng suất cao hơn những lúa cổ truyền 2 tấn/ha [53]. Gregorio và cs (2002) đã báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn. Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao cây, cảm quang, yếu rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo xấu), tác giả đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởng mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali. Giống lúaTCCP226-2-49-B-B-3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [27]. Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29. Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp hồi giao vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt [30]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống là mất nhiều thời gian. Thông thường thì 6-8 lần hồi giao cần được thực hiện, tương đương với 3-4 năm lai tạo. Một khó khăn khác thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp mất đến 10 hoặc 15 năm để phát triển một giống lúa mới [22]. Ngoài ra, việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen của tính trạng chống chịu mặn. Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh. Theo Islam (2004) thì hệ số di truyền của tính chống chịu mặn thấp (<19,18%), nên tính chống chịu mặn của các dòng con lai thường không cao như bố me có gen sẵn có [31]. Để khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống, người ta kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử. Xu và cs (1996) đã chuyển gen hvaI của lúa mạch vào giống lúa Nipponbare. Cây lúa chuyển gen và không chuyển gen sau 3 tuần tuổi được xử lý mặn 2 vòng: lần đầu với 200 mM NaCl trong 10 ngày, tiếp theo là không xử lý mặn 10 ngày; lần hai xử lý mặn 30 ngày với 50 mMNaCl. Tác giả ghi nhận là cây lúa chuyển gen có tốc độ sinh trưởng và phục hồi tốt hơn cây lúa không chuyển gen khi bị xử lý mặn và không xử lý mặn [65]. Jang và cs (2003) đã chuyển gen trehalose 6-phosphate synthase và trehalose 6-phosphate phosphatase dưới sự kiểm soát của promoter ubiquitine của bắp, đã làm gia tăng sự tích luỹ của treholose trong cây lúa chuyển nạp gen và làm tăng tính chống chịu mặn, hạn, lạnh [54]. Ohta và cs (2002) cũng đã chuyển gen Na+/H+ antipoter vào giống lúa mẫn cảm với mặn Kinhuikari. Cây lúa chuyển nạp gen sống sót sau khi thanh lọc mặn ở mức 300 mM NaCl trong 3 ngày, các cây lúa không được chuyển gen đều chết [49]. Nagamiya và cs (2007) lại chuyển nạp gen kat E, một catalase gen, vào giống lúa japonica. Các cây lúa được chuyển gen sống và phát triển hơn 14 ngày trong môi trường mặn có hàm lượng muối 250 mM, trổ bông và cho hạt ở nồng độ muối 100 mM. Khi đánh giá mức độ biểu hiện của gen catalase trong cây lúa được chuyển gen, hoạt động của enzyme Catalase tăng lên khoảng 1,5-2,5 lần so với cây lúa không được chuyển gen [47].
Từ năm 1992-1995 Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam đã tiến hành thanh lọc mặn cho 88 giống lúa địa phương và 100 giống lúa nước của IRRI với giống Pokkali làm đối chứng chống chịu mặn. Kết quả chọn được 14 giống triển vọng, trong đó có 2 giống từ bộ giống của IRRI là: FRG67, ROHYD15 và 12 giống lúa từ tập đoàn giống của cổ truyền là: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân Hương, Tam sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nưng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng Co đỏ, Bảy Dảnh, Một Bụi trong đó đặc biệt chú ý đến giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan, cho năng suất cao, chống chịu mặn tốt, phẩm chất gạo tốt [12]. Nguyễn Thị Lang và cs, 2002 đánh giá tính chống chịu mặn của 62 giống lúa cổ truyền, với Pokkali là giống chuẩn kháng và giống IR29 là giống chuẩn nhiễm đã thu được các giống chống chịu mặn là: Nếp áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp Bờ Giếng [7]. Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) đã nuôi cấy mô 10 giống, bao gồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3-5). Kết quả cho thấy : trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ tái sinh cao [10]. Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co60) đã cho ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các giống lúa CM1, CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [2]. Ngô Đình Thức (2006) cũng đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túi phấn trong chọn tạo giống lúa chịu mặn đạt được kết quả khả quan. Tác giả tạo được 8 dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati và VD20 có khả năng chống chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với EC = 12 dS/m [13]. Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới. Một số giống lúa mới của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như: OM6976, OM6677, OM5464, OM5629, OM5166, OM 5451, OM 4059 và OM 6164 đã và đang được khảo nghiệm ở một số tỉnh như Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc Liêu. Kết quả khảo nghiệm ban đầu ghi nhận khá khả quan, trong đó giống lúa OM5464 đang được đề nghị nhân rộng và trình Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận là giống lúa sản xuất thử trong năm 2010. Hai giống OM6976 và OM5166 đang được tiếp tục khảo nghiệm, xác định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu mặn và năng suất của giống. Hai giống lúa mới này dự kiến xin công nhận trong năm 2011.
Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 38 giống có đặc tính chịu mặn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long (bảng 2.1). Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu
Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu (tiếp theo)
2.1.2. Hoá chất Hoá chất tách chiết ADN Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN và Labscan. - Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB): CTAB 1% Tris-HCl 0,1M EDTA 0,5M, pH 8,0 NaCl 5M
-mercapthoethanol 14M - TBE 5x (Tris-borat buffer): Tris base Boric acid EDTA 0,5M, pH 8,0 - TE buffer pH = 8,0 Tris 1M, pH = 8,0 NaCl 5M
EDTA 0,5M, pH 8,0 Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR: - Đệm PCR 1x (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen. - MgCl2 của Fermentas, Invitrogen. - dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen. - Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low của hãng Fermentas, Invitrogen. - Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen
Hoá chất chạy điện di: - Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS, Temed, chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide. Các mồi SSR: 30 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau đã được McCouch (2002) và cộng sự công bố (bảng 2.1) [40]. Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu
Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu (tiếp theo)
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch 2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) [48]. Quy trình tách chiết như sau: Nghiền 1,5 – 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ. Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 650C). Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30 phút. Tủa DNA bởi máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h. Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol- chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút. Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy DNA ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh. Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C. 2.2.1.2. Đo độ tinh sạch của ADN Độ tinh sạch và nồng độ của ADN được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5x (108g Tris base (MW = 121,10); 27,5g Axít boric (MW = 61,83); 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) và dùng marker ADN chuẩn có nồng độ (50 ng/µl) để so sánh. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng ethidium bromide. Việc chụp ảnh mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy Molecular imager FX. 2.2.2. Thành phần phản ứng PCR với mồi SSR Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler - Personal. Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở bảng 2.3. Bảng 2.3: Thành phần của một phản ứng PCR
2.2.3. Chương trình chạy PCR Chu trình nhiệt PCR như sau: Bảng 2.4: Các bước phản ứng PCR
2.2.4. Nhuộm gel và ghi nhận kết quả Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6-8%, trong môi trường đệm TBE 1x, Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low. Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR được tiến hành như sau:
- Điện di sản phẩm: Khi gel đông lại (sau khoảng 30-60 phút), rút lược ra, vệ sinh bản gel bằng TAE 1x, cho khay chứa gel vào máy điện di có sẵn dung dịch đệm TBE 1x. Lấy 3µl mẫu (chứa sản phẩm của quá trình PCR), trộn đều với 3µl dung dịch loading dye 1,5x và tra vào các giếng. Sau đó, đặt máy điện di ở chế độ 200V trong thời gian 2-2,5 giờ. Để đo kích thước băng chúng tôi sử dụng Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low làm chuẩn. - Nhuộm gel và ghi nhận kết quả: Sau khi điện di, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (0,5 ng/ml) trong 30 phút. Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của hãng UVP. 2.2.5. Phân tích và xử lí số liệu Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN (các allele). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1. Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: PIC =1 - Pi2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i). Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: 
Trong đó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR. M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. Y: là tổng số mồi SSR có xuất hiện băng ADN. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: 
Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA. M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Tách chiết axit nucleic là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong công nghệ ADN. Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết axit nucleic ngày nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số của mẫu thực vật. Tuy nhiên đối với từng đối tượng mẫu thực vật nhất định cần có phương pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến phương pháp cho phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan trọng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên cứu. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất tẩy Cetyl - Trimethyl - Amonium - Bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ [48]. 
Hình 3.1: ADN tổng số của 38 giống lúa nghiên cứu Sau khi thu được ADN, chất lượng AND được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% (hình 3.1). Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy các băng ADN thu được của các giống lúa khá gọn và đồng đều, chứng tỏ chất lượng ADN của các mẫu là khá tốt, không bị đứt gãy hay lẫn tạp. Mặt khác không thấy xuất hiện vệt sáng ARN phía dưới, điều đó chứng tỏ ARN cũng đã được loại bỏ khỏi dịch chiết ADN. Kết quả điện di cũng cho thấy ADN có nồng độ tương đối cao, chất lượng tốt đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền của tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn bằng chỉ thị phân tử SSR 3.1.2.1. Kết quả phân tích đa hình di truyền với một số mồi điển hình. Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của tập đoàn lúa chịu mặn, chúng tôi đã sử dụng sản phẩm ADN tách chiết ở trên làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với 30 mồi nghiên cứu. Sản phẩm PCR của từng mồi được điện di trên gel polyacrylamide. Mồi RM341 
Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM341 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 38 giống lúa chịu mặn với cặp mồi RM341 (hình 3.2) cho thấy: xuất hiện 7 loại allele khác nhau với kích thước khoảng 128bp - 184bp, kích thước các allele này đều nằm trong khoảng đã được công bố trước đó (bảng 2.1) [40]. Giống Nếp mặn xuất hiện allele hiếm, có kích thước khoảng 148bp. Có 3 giống Giống có kiểu gen dị hợp ở locus RM341 bao gồm: Chiêm mặn, Lúa nước mặn và Nếp Quảng Ngãi. Mồi RM337 
Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM337 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 38 giống lúa chịu mặn với cặp mồi RM337 (hình3.3) cho thấy: xuất hiện 8 loại allele khác nhau với kích thước khoảng 155bp - 192bp, kích thước các allele này đều nằm trong khoảng đã được công bố trước đó (bảng 2.1) [40]. Giống chiêm mặn, OM9915, OM9921 và Nàng neo xuất hiện allele có kích thước lớn nhất khoảng 192bp, giống Chiêm đỏ, Đốc phụng 2, OM5464, OM5166 và OM 4059 xuất hiện allele có kích thước nhỏ nhất khoảng 155bp. Có 5 giống có kiểu gen dị hợp ở locus RM337 bao gồm: Lúa ven, Chiêm đỏ, Lúa bông dừa, Trắng chùm và Nàng neo. Mồi RM245 
Hình 3.4: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM245 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 38 giống lúa chịu mặn với cặp mồi RM245 (hình3.4) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước khoảng 137bp - 146bp, kích thước các allele này đều nằm trong khoảng đã được công bố trước đó (bảng 2.1) [40]. Giống chiêm mặn, Lúa nước mặn, OM5981, OM5464 và OM4059 xuất hiện allele có kích thước lớn nhất khoảng 146bp, giống Nếp Quảng Ngãi, Lúa ngoi, Ngoi tía, Nếp cúc và OM5464 xuất hiện allele có kích thước nhỏ nhất khoảng 137bp. Có 3 giống có kiểu gen dị hợp ở locus RM245 bao gồm: Chiêm mặn, Lúa nước mặn và OM5464. Каталог: phenotype -> upload -> article article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7) article -> MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ article -> Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5) article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3 article -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4 article -> Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng article -> Xanthomonas oryzea pv oryze, đ tải về 2.41 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||