I. ĐẶt vấN ĐỀ

I. ĐẶT VẤN ĐỀ:

Việc lưu giữ và bảo tồn nguồn gen quý hiếm của các loài cây nguyên liệu giấy nói riêng và các cây thân gỗ nói chung là việc làm rất cần thiết, đã và đang được nhiều nước trên thế giới chú ý.

Năm 1985 bảo tồn đa dạng sinh học được bắt đầu và đến năm 1992 các hoạt động này được triển khai. Đây chính là nền móng cho sự bảo tồn đa dạng sinh học.

Hiện nay các ngân hàng gen cây trồng trên thế giới đang lưu giữ 6.5 triệu mẫu giống, trong đó 87% ở ngân hàng gen quốc gia và 11% ở các ngân hàng gen của các cơ quan nghiên cứu do CGIAR quản lý.

Khu vực Châu á - Thái Bình Dương, Đài Loan và Hàn Quốc mới xúc tiến nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen cây trồng (1980), nhưng là một trong số mười quốc gia có ngân hàng gen cây trồng lớn nhất thế giới, đang bảo tồn trên 100.000 mẫu giống.

Công ty Aracruz (Braxin), ngay từ những năm 1984 đã chọn 5.000 cây trội từ 36.000 ha rừng trồng bạch đàn. Từ đó đã chọn ra 150 dòng phù hợp nhưng chỉ sử dụng 31 dòng tốt nhất vào chương trình trồng rừng. Năm 1989, vốn gen của họ có 2.000 xuất xứ của 56 loài bạch đàn, trên 7.000 cây đã được kiểm tra đánh giá và 100 cây chứng tỏ có triển vọng cao.

Ôxtrâylia, năm 1972 đã tiến hành xây dựng các khu bảo tồn gen in situ cho bạch đàn với mục tiêu bảo tồn nguồn gen hơn là bảo tồn các cây cá thể. Yêu cầu cơ bản là duy trì các quần thể bằng cách tái sinh tự nhiên hoặc nhân tạo từ nguồn hạt giống thu hái trong khu bảo tồn và tái tạo thế hệ mới từ nhiều cây cá thể.

FAO đã đầu tư cho xây dựng một số khu bảo tồn ex situ cho bạch đàn ở một số nước như Thái Lan, ấn Độ, Nigiêria, Băng-la-đét...

ở Trung Quốc, từ những năm 1978 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Khâm Châu tỉnh Quảng Tây đã tiến hành bảo tồn nguồn gen bạch đàn bằng in vitro. Sau đó hình thức bảo tồn này được áp dụng rộng rãi ở nhiều nơi (Viện khoa học lâm nghiệp Quảng Tây, Viện khoa học lâm nghiệp Quảng Đông...) cho các đối tượng: bạch đàn, thông, keo và một số loài cây khác.

ở Việt Nam, trong những năm qua việc bảo tồn và lư­u giữ nguồn gen cây lâm nghiệp nói chung và cây nguyên liệu giấy nói riêng mới đ­ược bảo tồn ở hình thức Insitu và Exsitu. Năm 2001 Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy bắt đầu bảo tồn nguồn gen cây nguyên liệu giấy bằng hình thức In vitro.

Công tác chọn giống và nhân giống đã đư­ợc xác định là công tác then chốt trong việc nâng cao năng suất rừng trồng, ngoài việc tuyển chọn và đ­ưa vào sản xuất những giống năng xuất cao thì việc bảo quản các nguồn gen và l­ưu giữ các giống tốt trong điều kiện vô trùng để giữ lại những nguồn giống "sạch bệnh" cho sản xuất là việc làm cần thiết. Việc bảo tồn nguồn gen quý có thể đ­ược thực hiện bằng nhiều cách khác nhau, nh­ưng việc ứng dụng công nghệ sinh học - nuôi cấy mô tế bào thực vật trong lư­u giữ và bảo tồn nguồn gen là việc làm mang lại nhiều lợi ích so với các ph­ương pháp khác. ở nhiều n­ước trên thế giới đã áp dụng rộng rãi ph­ương pháp này và đã mang lại hiệu quả cao.

Trong những năm qua Viện đã sử dụng các nguồn gen làm vật liệu nhân giống cây đầu dòng và cây con chất lượng cao phục vụ công tác nhân giống và trồng rừng nguyên liệu giấy. Hiện nay đã có hàng ngàn ha rừng trồng công nghiệp từ cây mô, hom phục vụ nguyên liệu cho nhà máy giấy với năng xuất bình quân 20 - 25 m³/ha/năm.

Tuy nhiên thực tế sản xuất hiện nay còn đang sử dụng chưa nhiều các xuất xứ có triển vọng và các dòng vô tính chọn lọc để thay thế các giống đ­ược trồng từ hạt xô bồ không tuyển chọn. Mặt khác, để đáp ứng nguyên liệu cho mục tiêu của ngành giấy Việt Nam phấn đấu đạt 2,2 triệu tấn bột giấy vào năm 2010 thì công tác chọn giống, bảo tồn, l­ưu giữ và phát triển nguồn gen là không thể thiếu và tập đoàn quỹ gen cây nguyên liệu giấy cần phải đ­ược nâng cao cả về số lư­ợng và chất lư­ợng thì mới đáp ứng được nhu cầu thực tế hiện nay.

II. MỤC TIÊU:

Nghiên cứu bảo tồn và lưu giữ an toàn nguồn gen quý hiếm của cây nguyên liệu giấy

III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1. Điều tra, khảo sát, thu thập và chọn lọc nguồn gen cây nguyên liệu giấy:

Bao gồm: 20 giống

2. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen

 Bảo tồn In vitro

 Bảo tồn EX SITU

3. Đánh giá chất lượng nguồn gen theo các chỉ tiêu sinh học:

- Khả năng nhân giống in vitro.

- Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các giống đưa vào bảo tồn.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu quản lý nguồn gen

• Xây dựng cơ sở dữ liệu về: nguồn gốc giống, các đặc tính sinh học, đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các giống đã bảo tồn và lưu giữ.

• Tư liệu hoá qua phim ảnh và toàn bộ số liệu đánh giá nguồn gen trong phần mềm lưu giữ.

• Cung cấp các thông tin về nguồn gen phục vụ công tác lai tạo giống mới có năng xuất cao và chất lượng tốt.

IV. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

1. Thu thập nguồn gen:

• Thu thập nguồn gen các giống bạch đàn, keo nhập nội đã được thuần hoá tại Việt Nam trong trương trình cải thiện giống của Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy và Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam.

• Sử dụng phương pháp đánh giá của Burlay - Wood (1976) và của Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy (phụ lục 1).

2. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen:

Bảo tồn và lưu giữ In vitro

Mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh và chồi bên, mẫu đ­ược rửa sạch bằng xà phòng, sau đó khử trùng trong cồn 70⁰ và xử lý lần l­ượt trong hypcolorit canxi 3% trong 15 phút, HgCl₂ 0,05% trong 5 phút. Sau đó, mẫu đ­ược rửa nhiều lần bằng nư­ớc vô trùng và đ­ược đ­ưa vào nuôi cấy.

Sử dụng môi trường nuôi cấy Murashige - Skooge 1962 (MS) có bổ sung đường saccaroze 30g/l, agar 6g/l, tổ hợp các chất điều hoà sinh tr­ưởng (ĐHST) khác nhau gồm 6-Benzyl adenin (BA), Indol acctic acid (IAA), a Naphyl acetic acid (NAA), Indol butyric acid (IBA), chế phẩm kích thích ra rễ (ABT), một số vitamin khác và pH = 5,8 tr­ước khi hấp vô trùng.

Từ một chồi ban đầu sau một thời gian nuôi cấy phát triển thành nhiều chồi (cụm chồi). Cụm chồi qua nhiều lần cấy chuyển tạo thành các bình giống gốc. Lưu giữ các bình giống gốc này trong môi trường bảo tồn (phụ lục 2) với điều kiện bảo tồn: Nhiệt độ: 10⁰c

Cường độ ánh sáng: 1.000 lux

Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày.

Khi cần khai thác và phát triển những nguồn gen này thì tiến hành cấy chuyển vào môi trường nuôi chồi, thúc rễ để tạo thành cây con hoàn chỉnh (sơ đồ bảo tồn và lưu giữ nguồn gen: phụ lục 3)

Thí nghiệm đ­ược bố trí ngẫu nhiên theo khối, lặp lại 3 lần và được đánh giá theo các chỉ tiêu sau:

å mẫu thành công

Tỷ lệ mẫu thành công = ---------------------- ´ 100 (%)

å mẫu cấy

å số chồi tạo thành

Hệ số nhân chồi = ------------------------

å số chồi ban đầu

å số chồi hữu hiệu

Tỷ lệ chồi hữu hiệu = ------------------------

å số chồi tạo thành

Để đánh giá theo các chỉ tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành đếm số chồi tạo thành, số chồi hữu hiệu (chồi có cấu trúc thân, lá, đỉnh rõ ràng, cao từ 0,3cm trở lên). Quan sát hình thái, tính chiều cao trung bình để đánh giá khả năng sinh trưởng của chồi. Chiều cao của chồi đ­ược tính từ ngọn đến vị trí tiếp xúc giữa chồi với bề mặt môi trư­ờng.

Bảo tồn EX SITU

* Tại Tiên Kiên – Lâm Thao – Phú Thọ: Trồng 15 dòng bạch đàn với mật độ 1660 cây/ha, mỗi dòng 10 cây, lặp lại 5 lần. Thiết lập thí nghiệm tháng 5/2005. Năm 2007 tiếp tục theo dõi đánh giá sinh trưởng (Sơ đồ thí nghiệm: Phụ lục 4)

* Tại Gia Thanh – Phù Ninh – Phú Thọ: Trồng 22 dòng (18 dòng bạch đàn và 4 dòng keo) với mật độ 1660 cây/ha, mỗi dòng 1 cây, lặp lại 5 lần. Thiết lập thí nghiệm tháng 5/2006. Năm 2007 tiếp tục theo dõi đánh giá sinh trưởng (Sơ đồ thí nghiệm: Phụ lục 5)

* Tại Phù Ninh – Phù Ninh – Phú Thọ: Trồng 46 dòng (26 dòng bạch đàn và 20 dòng keo) với mật độ 1660 cây/ha, mỗi dòng 1 cây, lặp lại 10 lần. Thiết lập thí nghiệm tháng 5/2007 (Sơ đồ thí nghiệm: Phụ lục 6)

ở cả ba địa điểm trồng, chăm sóc theo quy trình trồng rừng thâm canh cây nguyên liệu giấy của Tổng Công ty giấy Việt Nam ban hành.

Đo đếm số liệu: Hvn, D1.3m, Doo, Dt và một số chỉ tiêu khác như sâu bệnh, cấp sinh trưởng.

Phân tích số liệu theo chương trình EXCEL và phần mềm SPSS 11.5.

Một số thí nghiệm sử dụng phư­ơng pháp thống kê Duncan Multiple Range Test.

Phương pháp chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn TAPPI T 257 cm – 85

Cây lấy mẫu được cắt bỏ đoạn ngọn có đường kính nhỏ hơn 5 cm. Phần còn lại được lấy 3 mẫu cách đều nhau (một mẫu ở phần giữa, một mẫu ở phần gốc và một mẫu ở phần ngon). Mỗi mẫu có chiều dài 1 m và được bóc sạch vỏ. Mẫu gỗ được lấy để phân tích thành phần hoá học được lấy từ 3 đoạn trên, mỗi đoạn được lấy 3 khoanh (một khoanh ở giữa, hai khoanh ở hai đầu). Mỗi khoanh dầy 2,5 cm. Các khoanh này được chẻ thành 8 phần, lấy 2 phần đối diện nhau để tiếp tục chẻ nhỏ. Các mẫu gỗ đã chẻ nhỏ được nghiền thành bột và rây qua sàng có lỗ 0,4 mm. Bột dưới sàng dùng để phân tích thành phần hoá học,

Hàm lượng xenluylô: phương pháp Kiursher – Hofft

Hàm lượng lignin: phương pháp TAPPI T222 om – 98

Hàm lượng pentozan: phương pháp TAPP1 19 wd – 71 (phương pháp thể tích)

Hàm lượng các chất tan trong axeton: phương pháp TAPPT 280 pm – 99

Hàm lượng tro: phương pháp TAPPI T211 om – 93

V. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:

1. Điều tra, khảo sát, thu thập và chọn lọc nguồn gen

Bạch đàn:

Loài Bạch đàn E. Urophylla (có nơi còn gọi là bạch đàn đỏ), có phân bố tự nhiên ở một số quần đảo như: Timor, Flores....thuộc Indonesia. Loài cây này được di thực nhiều nơi trên thế giới và được du nhập vào Việt Nam từ những năm 1976 và từ đó mỗi năm có hàng ngàn ha rừng trồng trong vùng nguyên liệu giấy Bãi Bằng, bao gồm các tỉnh: Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Yên Bái, Tuyên Quang. Sau đó được mở rộng ra các tỉnh khác như: Bắc Giang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Thừa Thiên Huế, Bình Định...

Từ năm 1979, Viện đã khảo nghiệm hơn 80 loài và xuất xứ trên 43 điểm/lập địa. Kết quả đã chọn được 4 loài: E. camaldulensis, E. Tereticornis, E.urophylla, E.grandis x E.urophylla và các xuất xứ: Pettford (Queensland – Australia) của loài E. Camaldulensis, xuất xứ Lewotobi (Indonesia) của loài E.urophylla. Các khảo nghiệm dòng dõi (kể cả các dòng dõi tự do thụ phấn và dòng vô tính) của các loài trên cũng đã đ­ược triển khai cùng với việc chọn đư­ợc 200 cây trội. Trong tổng số 200 cây trội đó đề tài tiến hành điều tra, khảo sát và chọn lọc các nguồn gen: BTT02, BTT03, BNM13, BNM12, BNM12b, BNM11, BNM8, BNM9, BNM7. Trong khu vực rừng trồng bạch đàn vô tính của Công ty lâm nghiệp Tam Thanh đề tài chọn một số cây trội “đột biến”: BĐB1, BĐB2. Ngoài ra đề tài còn sử dụng các nguồn gen trong trương trình cải thiện giống của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam: UE34, CU91, UE89, UE24, UE85,UE35, UC80, UU8.

Keo:

Năm 1981, Viện đã khảo nghiệm trên 100 loài ở 30 điểm/lập địa và đã chọn ra một số loài sinh trư­ởng nhanh, phát triển tốt. Đó là các loài A. Mangium, A. crasicarpa, A. aulacocarpa, A. mangium x A.auriculifocmis, A.auriculifocmis x A. mangium. Các xuất xứ tốt như­: Iron Range, Cardwell, Mossman của loài A.mangium. Đã tuyển chọn đ­ược 100 cây trội và từ đó đề tài đã tiến hành điều tra, khảo sát và lựa chọn các nguồn gen: KBC1, KNM7, KNM8, XXRG1, XXRG2, XXRG3, XXRG4, XXRG5, XXRG6, XXRG7, XXRG8, XXRG9, XXRG10. Ngoài ra đề tài đã tiến hành tuyển chọn các dòng sinh trưởng vượt trội của các xuất xứ nhập ngoại: H3, H5, XX 16679, XX20132, XX20135, XX20865,

Thông:

Để nghiên cứu chọn loài phục vụ trồng rừng cung cấp nguyên liệu sợi dài. Từ những năm 1975 Viện đã triển khai trồng thử 23 xuất xứ của 4 loài thông nhiệt đới P. caribea, P. Oocarpa, P. Kesiya và P. Merkusii trên 4 dạng lập địa của vùng nguyên liệu giấy trung tâm. Kết quả đã chọn đư­ợc loài P. Caribaca hondurensis với xuất xứ từ Mountain Pine Ridege thuộc Cộng hoà Belize đư­a vào trồng ở phía nam nguyên liệu. Đã chọn ra đư­ợc 100 cây trội.

Từ các kết quả trên đề tài đã tiến hành điều tra, khảo sát và lựa chọn nguồn gen: PCHĐN, PCHĐNK. Ngoài ra đề tài còn sử dụng các nguồn gen trong trương trình dự án Card 032/05 VIE của Australia: PCHxPCC, PEExPCH, PCHQ.

Bảng 01: Thu thập và tuyển chọn nguồn gen quý hiếm

2. Đánh giá nguồn gen:

2.1 Khả năng nhân giống In vitro

Trong nuôi cấy mô tế bào, tạo chồi là một bư­ớc khó bởi mẫu nuôi cấy đã tách rời hoàn toàn khỏi cơ thể mẹ. Khả năng tạo chồi một mặt phụ thuộc vào bản thân mẫu nuôi cấy, mặt khác phụ thuộc rất nhiều vào môi tr­ường nuôi cấy. Để cho mẫu nuôi cấy có thể tiếp tục sống và phát triển, phân hoá các tế bào thành chồi non, hình thành rễ tạo cây con hoàn chỉnh thì ngoài các chất dinh dư­ỡng, khoáng, vitamin...cần bổ sung các chất điều hoà sinh tr­ưởng vào môi trư­ờng nuôi cấy. Với tổ hợp hormon thích hợp sẽ làm cho các hoạt động sinh lý bên trong của mô nuôi cấy phát triển theo chiều hư­ớng gia tăng có lợi và dẫn đến kích thích các chồi ngủ tiềm ẩn ở các đỉnh sinh tr­ưởng phát triển và phân hoá thành chồi mới.

Nhân chồi và tạo ra được nhiều chồi hữu hiệu là giai đoạn quan trọng quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Số l­ượng chồi (hệ số nhân chồi) càng nhiều thì khả năng nhân giống càng lớn và ngư­ợc lại. Vì vậy chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng nhân giống của các nguồn gen đưa vào lưu giữ với hai chỉ tiêu quan trọng nhất là hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

Bảng 02: Khả năng nhân giống In vitro

KÕt qu¶ cho thÊy tuy hÖ sè nh©n chåi vµ tû lÖ chåi h÷u hiÖu cã sù kh¸c nhau gi÷a c¸c loµi c©y nh­ng víi kÕt qu¶ nµy hoµn toµn cã thÓ ®¸nh gi¸ lµ c¸c nguån gen nµy ®Òu cã kh¶ n¨ng nh©n gièng in vitro.

2.2 Nuôi cấy trở lại điều kiện bình thường sau thời gian lưu giữ

Tiến hành cấy chuyển toàn bộ bình giống gốc sau thời gian lưu giữ vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy của dây truyền nuôi cấy mô tế bào. Kết quả cho thấy mẫu nuôi cấy sinh trưởng bình thường và không ảnh hưởng gì đến hình thái, hệ số nhân chồi cũng như tỷ lệ ra rễ của mẫu nuôi cấy. Điều này khẳng định việc bảo tồn và lưu giữ theo phương pháp trên là rất an toàn và khoa học.

2.3 Đánh giá đặc điểm sinh trưởng phát triển của cây in vitro

Trong 3 đối tượng đưa vào bảo tồn và lưu giữ, hiện tại chỉ có bạch đàn là có khả năng lớn nhất để khai thác và phát triển nguồn gen cho sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Vì vậy chúng tôi tiến hành đánh giá sức sống của cây in vitro cho riêng loài bạch đàn.

2.3.1 Đánh giá theo tỷ lệ sống

Bảng 03 : Tỷ lệ sống của cây con (%)

Kết quả cho thấy tỷ lệ sống rất cao, tỷ lệ sống trung bình của tất cả các dòng đưa vào thử nghiệm là 95%. Sau thời gian thích nghi với điều kiện sống từ trong ống nghiệm ra ngoài tự nhiên (10ngày) tỷ lệ sống của cây có giảm nhưng không nhiều theo thời gian (kết quả đo tại thời điểm 60 ngày và 90 ngày không có sự thay đổi).

2.3.2 Sinh trưởng, phát triển đường kính và chiều cao

Bảng 04: Đường kính gốc và chiều cao bình quân của cây con 2,5 tháng tuổi

Kết quả đo và phân tích tại thời điểm 2.5 tháng tuổi cho thấy có sự sai khác về đường kính và chiều cao giữa các dòng nhưng sự chênh lệch này là không lớn.

Trong cùng một thời điểm các dòng PN41, CTIV, PN7 luôn luôn là dòng sinh trưởng tốt nhất cả về đường kính và chiều cao.

2.3.3 Trọng lượng cây con

Để đánh giá đầy đủ hơn về chất lượng cây con, tiến hành cân trọng lượng tươi và trọng lượng khô của từng cây.

Bảng 05: Trọng lượng tươi và khô bình quân của cây con

2.5 tháng tuổi (g)

Kết quả cho thấy có sự khác nhau giữa các dòng đưa vào thử nghiệm. Trọng lượng tươi bình quân của các dòng là 11.8 g. Trọng lượng khô bình quân của các dòng 2.13 g .

2.3.4 Sự phát triển của hệ rễ

Phân tích sự phát triển của hệ rễ bằng cách đếm số rễ chính và cân trọng lượng khô của rễ.

Số lượng rễ phản ánh rất rõ đến chất lượng cây con, dòng U6 và dòng PN3d có số lượng rễ và trọng lượng rễ khô nhỏ hơn các dòng khác nên đường kính gốc, trọng lượng tươi và khô của cây con nhỏ hơn các dòng khác.

Dòng CT3 và dòng PN41 có hệ rễ rất phát triển, vì có hệ rễ phát triển nên các chỉ tiêu đo đếm khác cũng cho kết quả cao, đây là 2 dòng bước đầu được đánh giá vượt trội trong giai đoạn vườn ươm.

2.3.5 Khả năng kháng bệnh của các giống