Phức chất của nguyên tố đất hiếm với amino axit và hệ enzyme từ vi sinh vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như nông nghiệp và y học. Trong nghiên cứu này, hệ enzyme endochitinase/protease từ L. lecanii và phức chất Tb(Asp)3PhenCl3.3H2O được sử dụng để chống lại nấm bệnh thực vật. Kết quả cho thấy, endochitinase và protease từ L. lecanii có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani; hoạt tính ức chế tăng lên khi kết hợp 2 enzyme endochitinase và protease, sự ức chế lần lượt đạt 80 và 85%. Phức chất Tb(Asp)3PhenCl3.3H2O có khả năng ức chế sự phát triển của 2 loài nấm này ở nồng độ 60 µg/ml mạnh hơn so với các phối tử o-phenyl và L-aspactic; sự ức chế lần lượt đạt 76 và 56% so với đối chứng. Kết quả nghiên cứu này mở ra hướng ứng dụng tạo chế phẩm sinh học từ enzyme và phức chất chống lại nấm bệnh cây trồng và góp phần bảo vệ ô nhiễm môi trường.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Các loài vi sinh vật gây bệnh cho người và cây trồng hiện nay đang là mối đe dọa lớn cho nhân loại. Việc sử dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học gây ảnh hưởng lớn tới sức khỏe con người, làm ô nhiễm môi trường và gây hiện tượng nhờn thuốc. Trên Thế giới cũng như ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học thay thế thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh do vi sinh vật gây ra đang là xu hướng chủ yếu. Nhiều loài nấm ký sinh côn trùng, xạ khuẩn và vi khuẩn được biết đến trong quá trình kiểm soát sinh học; trong số đó có nấm
L. lecanii.
Lecanicillium lecanii được biết là loài nấm kí sinh côn trùng như rệp và bướm trắng.
L. lecanii có phổ vật chủ rộng gồm côn trùng có cánh, động vật chân đốt, sâu và bướm [9]. Các chủng
L. lecanii đã được sử dụng để tạo ra thuốc trừ sâu sinh học như Vertalec diệt rầy nâu và Mycotal diệt bướm trắng [8]. Nấm gây bệnh trên côn trùng dựa trên sự xâm nhập của các bào tử. Trong quá trình nẩy mầm, bào tử tổng hợp protease, chitinase và lipase giúp các ống mầm xâm nhập vào lớp biểu bì đồng thời các enzyme hủy hoại hệ thống mô, cơ quan của côn trùng. Sợi nấm xâm nhập vào khoang máu, lưu thông qua các chất lỏng của côn trùng và hình thành khối mô dạng sợi nấm trên cơ thể côn trùng.
Hoạt tính kháng nấm của chúng liên quan tới việc sản xuất các hợp chất thứ cấp và một số enzyme thủy phân ngoại bào. Chitinase và protease được biết đến trong quá trình thủy phân thành tế bào của nấm [2]. Tiềm năng kháng nấm của L. lecanii trên cơ chế của các enzyme ngoại bào chưa được biết tới. Trong bài báo này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hệ enzyme (chitinase và protease) từ nấm L. lecanii và phức chất Tb(Asp)3PhenCl3.3H2O tới sự phát triển của nấm F. oxysporum và R. solanii gây bệnh cây trồng nhằm định hướng trong quá trình sản xuất chế phẩm sinh học góp phần bảo vệ sự ô nhiễm môi trường.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Chủng giống và môi trường nuôi cấy
Nấm L. lecanii do Phòng Các chất chức năng sinh học, viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp được nuôi cấy trong môi trường MT chứa (w/v): chitin huyền phù 0,75%; pepton 0,5%; KH2PO4 0,01%; MgSO4 0,05%; cao nấm men 0,5% ở 30°C, pH 6,5 cho quá trình sinh tổng hợp chitinase và protease.
Nấm Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây trồng do phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp được nuôi cấy trên môi trường PDA chứa (w/v): glucose 2,0%; 200g dịch chiết khoai tây; thạch agar 2,0% để khảo sát sự ức chế bởi enzyme và phức chất.
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ở dạng tinh khiết, Chitin từ công ty HiMedia (Mumbai, Ấn Độ); Peptone và cao nấm men từ công ty Bio Basic Inc. (New York, Mỹ); phức chất Tb(Asp)3PhenCl3.3H2O do Khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp.
2.2. Phương pháp
Xác định hoạt tính endochitinase: Một phản ứng gồm 0,2 ml dịch enzyme được ủ với
0,6 ml cơ chất chitin huyền phù 0,5% pha trong đệm 0,1
M sodium photphat, pH 7,0 ở 40°C trong 2 giờ. Ngừng phản ứng bằng cách bổ sung 1 ml dung dịch DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) 1,0% và đun sôi cách thủy 10 phút sau đó ly tâm. Độ hấp phụ của hỗn hợp màu được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 540 nm (mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần) và đối chiếu với đồ thị chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine để tính ra lượng đường giải phóng trong dung dịch giữa enzyme và cơ chất. Một đơn vị hoạt độ được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân cơ chất chitin huyền phù giải phóng ra lượng đường khử tương đương 1,0 µmol N-acetyl glucosamine trong 1 giờ ở điều kiện thí nghiệm [4].
Xác định hoạt tính protease: Hoạt tính protease được xác định bằng phương pháp của Anson [6]. Một thể tích gồm 100 μl enzym được ủ với 1 ml dung dịch 1,0% (w/v) casein trong 50 mM đệm Tris-HCl, pH 8,5 ở 40°C trong 10 phút. Phản ứng được dừng lại bằng việc bổ sung 2,5 ml 5,0% TCA và giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Hỗn hợp phản ứng li tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. 500 μl dịch được hút sang ống khác, bổ sung 2 ml dung dịch 6,0% Na2CO3 lắc đều. Bổ sung 500 μl dung dịch 0,2 N Folin Ciocalteau lắc đều, sau 30 phút phản ứng màu được đo ở bước sóng 750 nm.
Xác định khả năng phân giải sợi nấm của chitinase: hỗn hợp phản ứng (1,0 ml) chứa 2 mg/ml sợi nấm F. oxysporum hoặc R. solani với 200 µl enzyme hoặc nước làm đối chứng được ủ ở 40°C trong 24 giờ. Lượng đường giải phóng trong hỗn hợp được xác định bằng cách bổ sung 1,0 ml DNS và đun sôi trong 10 phút. Các ống được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút [4].
Xác định hoạt tính kháng nấm của enzyme: Khoanh nấm F. oxysporum hoặc R. solani có đường kính 1,0 cm được đặt giữa đĩa PDA có bổ sung chitinase và protease (60 µg/ml) hoặc nước làm đối chứng. Hoạt tính ức chế của hệ enzyme tới sự phát triển sợi nấm được xác định sau 3 ngày ủ ở 30°C.
Xác định hoạt tính kháng nấm của phức chất và phối tử: Khoanh nấm
F. oxysporum hoặc
R. solani có đường kính 1,0 cm được đặt giữa đĩa PDA có bổ sung phối tử
o-phenyl, L-aspatic, phức chất Tb(Asp)
3PhenCl
3.3H
2O, ở nồng độ 60 µg/ml và sử dụng nước làm đối chứng. Hoạt tính ức chế của hệ phức chất và phối tử tới sự phát triển sợi nấm được xác định sau 3 ngày ủ ở 30°C.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sinh tổng hợp enzyme từ nấm L. lecanii
Kết quả phân tích hoạt tính enzyme từ nấm L. lecanii nhận thấy, hoạt tính endochitinase sinh ra đạt 0,73 U/ml và hoạt tính protease đạt 2,16 U/ml. Hai enzyme này được định tính trên đĩa thạch có chứa cơ chất 0,5% chitin huyền phù (đối với endochitinase) và 0,5% casein (đối với protease), kết quả xuất hiện các vòng phân giải màu trắng sau khi nhuộm bằng dung dịch lugol 1,0% đối với endochitinase (Hình 1A) và nhuộm bằng dung dịch comasine blue 0,5% đối với protease (Hình 1B). Như vậy, nấm L. lecanii chúng tôi nghiên cứu có khả năng sinh endochitinase và protease. Hệ enzyme này được sử dụng để nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển của nấm F. oxysporum và R. solani.
A
|
|