Tạ Thùy Linh nghiên cứu quy trình xử LÝ MẪu nưỚc tiểU ĐỂ phân tích một số chất ma túy tổng hợp nhóm ats bằng phưƠng pháp ce-c4d luận văn thạc sĩ khoa họC

• 
  Theo cơ chế tương tác hấp phụ của chất rắn (chất chiết pha thường, hệ NP, pha ngược, hệ RP)
  

X_i + SPE_x ↔ X_i.SPE_x

• 
  Theo cơ chế trao đổi ion (cation và anion)
  

Meⁿ⁺ + SPE_x-H ↔ SPE_x-Me + H⁺

• 
  Theo kiểu trao đổi tạo cặp ion
  

• 
  Theo kiểu hợp chất liên hợp phân tử, dạng RNH₂.HX
  

R-NH₂ + HCl = R-NH₂.HCl (phức liên hợp)

Sau đó nạp mẫu phức liên hợp này lên cột SPE, để chất chiết hấp thu phức liên hợp này và giữ lại trong cột chiết. Làm sạch cột chiết sau đó giải hấp chất R-NH₂.HCl bằng một dung môi thích hợp, ta sẽ thu được dung dịch của chất R-NH₂

• 
  Kiểu chiết rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn
  

Các loại cột SPE:

• 
  Loại chứa các chất như silica, florisil, amino alumina,… có gắn các nhóm như –OH, -NH2, -CN chủ yếu dùng để tách các chất tương đối phân cực. Phần lớn được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột gắn –CN có thể sử dụng trong pha đảo).
  
• 
  Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột SCX tách cation) .
  
• 
  Loại chứa các pha tĩnh như C18, C8, C2, cyclophenyl… là silic ghép các nhánh không phân cực dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.
  

+ Hiệu suất thu hồi cao

+ Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch

+ Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất

+ Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt

+ Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn

Eunyoung Hanvà các cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu nhằm xác định đồng thời các chất amphetamin, methamphetamin, 3,4-methylenedioxyamphetamin, 3,4-m ethylene-dioxymethamphetamin, N-methyl-1-(3,4-methyl-enedioxyphenyl)-2-butanamin, 3,4-methylenedioxyethylamphetamin, p-methoxymethamphetamin, ephedrin, N-methylephedrin, cathinon, methcathinon và ketamintrong nước tiểu. Cột Oasis MCX (1 mL, 30 mg; Waters, USA) được hoạt hóa bằng 1 mL MeOH, 1ml nước đề-ion. 4 mL mẫu nước tiểu (được axit hóa bằng 200 µL HCl 5 M, thêm 0,25 ng/mL dung dịch chất nội chuẩn MA-d₅) được rung siêu âm 5 phút ở tốc độ 8000 rpm sau đó được cho chảy qua cột MCX. Cột chiết được rửa với 1ml HCl 0,1M; 1 mL MeOH; 1 mL dung dịch amoniac 5%.Chất phân tích được rửa giải bằng 1 mL 5% amoniac trong MeOH. Hiệu suất thu hồi của các chất đều nằm trong khoảng 70,3 ÷ 107,9 %.

Các tác giả Đặng Đức Khanh, Trần Việt Hùng, Trần Thị Thúy [4] đã ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn với chất hấp phụ C8 để chiết và làm sạch ma túy trong mẫu nước tiểu. 5 ml nước tiểu đã ly tâm, loại cặn; thêm 2,5 ml đệm 0,1M phosphat pH = 6,0 được nạp vào cột SPE C8 (đã hoạt hóa bằng 3 ml methanol, 3 ml H₂O và 1 ml dung dịch đệm phosphat pH = 6,0) với tốc độ 1-3 ml/phút. Sau đó, cột SPE được rửa bằng 3 ml H₂O, 1 ml dung dịch axit acetic 0,1M, 3 ml hexan và 1 ml methanol.Chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml hỗn hợp CH₂Cl₂/isopropanol/amoniac (tỉ lệ 78/20/2).  Quy trình này cho độ thu hồi của chất phân tích trong khoảng từ 89,0-97,2%.

B.K. Gan cùng cộng sự [13] đã sử dụng cột chiết trao đổi ion (benzensulphonyl silica, 1mL) để xử lí mẫu nước tiểu. Quy trình như sau: Cột chiết được hoạt hóa bằng metanol (2 mL), nước cất (1 mL) và axit photphoric 10 mM (0,5 mL) dưới áp suất giảm. Lắc 1 mL nước tiểu với 0,5 mL axit photphoric 10 mM trong 1 ống nghiệm sau đó đưa vào cột chiết đã hoạt hóa. Sau khi đuổi hết không khí (khoảng 30 giây), rửa lần lượt bằng 1 mL axit photphoric 10 mM, 0,5 mL axit axetic 0,1 M và 1 mL metanol. Loại bỏ không khí trong cột, sau đó tiến hành rửa giải bằng 2 mL dung dịch amoniac 3%/metanol (v/v), làm khô dưới áp suất giảm dòng nitơ, thu cặn chiết và tiến hành phân tích.

Như vậy, có thể nhận thấy có nhiều phương pháp xác định các chất ma túy nhưng các phương pháp này đều đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, yêu cầu kỹ thuật cao. Tuy nhiên, phương pháp điện di mao quản cho thấy rất có tiềm năng bởi vì phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C⁴D) là phương pháp phân tích mới với những ưu điểm như: thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp, hoạt động đơn giản, có thể tự động hóa và triển khai phân tích ngay tại hiện trường với một lượng nhỏ mẫu và hóa chất phục vụ kịp thời quá trình điều tra. Do đó, chúng tôi tập trung nghiên cứu quy trình phân tích một số chất ma túy tổng hợp ATS trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, kết nối kiểu tụ điện.

Mục tiêu của luận văn là: Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu nước tiểu để phân tích một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS (gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA) bằng phương pháp điện di mao quản, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE-C⁴D).

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm:

- Tổng quan tài liệu về các phương pháp khác nhau để xác định đồng một số hợp chất ma túy tổng hợp nhóm ATS và các phương pháp xử lý mẫu nước tiểu.

- Xây dựng đường chuẩn của các chất phân tích.

• 
  Đánh giá phương pháp phân tích (xác định LOD, LOQ, độ đúng, độ chụm).
  
• 
  Nghiên cứu, tối ưu quy trình chiết lỏng và chiết pha rắn để xử lý làm sạch, làm giàu mẫu nước tiểu.
  
• 
  Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu do Viện Khoa học hình sự và Đội giám định hóa học – Phòng kỹ thuật hình sự - CATP Hà Nội cung cấp.
  
• 
  Thực hiện phân tích đối chứng một số mẫu bằng phương pháp GC/MS do Viện Khoa học hình sự thực hiện.
  

Phương pháp phân tích là phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE – C⁴D). Thiết bị này được thiết kế và chế tạo bởi Công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) trên cơ sở hợp tác với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (Thụy Sỹ), là thiết bị có nguồn thế cao lên đến 20kv, có thể thực hiện bán tự động (hình 2.1). Hệ thiết bị này hiện đang được triển khai nghiên cứu hoàn thiện và phát triển ứng dụng tại Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [1].

(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén)

*Các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu này gồm mẫu trắng là mẫu nước tiểu được lấy từ những người khỏe mạnh, không sử dụng bất cứ loại ma túy nào và mẫu nước tiểu thu của các đối tượng bị tình nghi đã sử dụng ma túy nhóm ATS.

*Xử lý mẫu nước tiểu: do hàm lượng chất phân tích có trong nước tiểu thường rất thấp nên cần được chiết tách để làm giàu mẫu và loại bỏ tạp chất trước khi bơm mẫu vào thiết bị CE. Sau khi tham khảo tài liệu [2] và khảo sát các điều kiện thiết bị, hóa chất, chúng tôi thực hiện quy trình chiết xuất như sau:

- Xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn: sử dụng cột C18 dung tích 3ml.

1. Hoạt hóa cột ( 3ml MeOH, 3ml H₂O, 3ml đệm phốt phát pH 6)

2. Nạp mẫu ( 5 ml nước tiểu, 0,5ml đệm phốt phát pH 6)

3. Rửa tạp chất ( 1ml H₂O, 2ml H₃PO₄ 10mM, 2ml MeOH/H₂O 1/9 v/v)

4. Rửa giải ( 2ml MeOH ngâm 5 phút), thu dịch chiết

5. Cô cạn dịch chiết bằng dòng khí nito, sau đó hòa tan vào MeOH và pha loãng với tỉ lệ thích hợp rồi tiến hành phân tích trên thiết bị CE.

- Xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết lỏng:(chiết lặp 2 lần)

1. Lấy mỗi mẫu 5 ml nước tiểu vào ống nghiệm có nắp xoáy

2. Kiềm hóa mẫu về pH 9 bằng dung dịch NH3 (kiểm tra bằng giấy quỳ) 3. Chiết mẫu bằng 3 ml etyl axetat, lắc trong vòng 10 phút.

4. Ly tâm cho tách lớp (tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 phút)

5. Hút lớp etyl axetat (lớp trên) đến khi hết dịch trong thì cho 200µl MeOH vào lắc nhẹ giúp làm giảm huyền phù trong mẫu rồi tiếp tục hút thu tiếp dịch chiết.

6. Cô cạn dịch chiết bằng dòng khí nito, sau đó hòa tan vào MeOH và pha loãng với tỉ lệ thích hợp rồi tiến hành phân tích trên thiết bị CE.

Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha chế bằng nước deion.

• 
  MA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ =80,2%)
  
• 
  MDA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 82,8%)
  
• 
  MDMA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 83,71%)
  
• 
  MDEA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 84,66%)
  

• 
  L- Arginine (C₆H₁₄N₄O₂) (Fluka, hàm lượng > 99,5%)
  
• 
  Axit acetic (CH₃COOH), (PA, Merck, Đức)
  
• 
  Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức)
  
• 
  Axit photphoric (H₃PO₄) (PA, Deajung, Hàn Quốc, 85%)
  
• 
  Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức)
  
• 
  Methanol (CH₃OH), (PA, Merck, Đức)
  
• 
  Etyl axetat (CH₃COOC₂H₅), (PA, Deajung, Hàn Quốc, >99,9%)
  
• 
  2-propanol (C₃H₈O), (PA, Deajung, Hàn Quốc, >99,8%)
  
• 
  Diclometan (CH₂Cl₂), (PA, Deajung, Hàn Quốc, 99%)
  

* Pha các dung dịch chuẩn gốc

Cân chính xác từng chất phân tích trên cân phân tích (độ chính xác 0,1mg): 0,0125 g MA, 0,0121 g MDA, 0,0119 g MDMA, 0,0118 g MDEA chuyển vào bình định mức 10,0 mL, thêm 4 mL Methanol và đem rung siêu âm 30 phút sau đó định mức đến vạch bằng nước deion ta được các dung dịch chuẩn gốc 1000ppm.

Các dung dịch chuẩn nồng độ nhỏ hơn được pha loãng bằng nước deion theo tỉ lệ thích hợp từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm trước khi phân tích.

* Pha dung dịch đệm điện di

Dung dịch pha động điện di kết hợp giữa Arginine và axit acetic được pha như sau: Cân chính xác 0,0435g Arginine chuyển vào cốc có mỏ 50,0 mL rung siêu âm trong 5 phút cho tan hết sau đó thêm từ từ axit axetic vào đến khi pH của dung dịch là 4.5 (sử dụng máy đo pH). Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày.

*Thiết bị

- Thiết bị điện di mao quản CE-C⁴D như đã trình bày ở mục 2.2.1.

- Thiết bị lọc nước deion (Mỹ).

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521.

- Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH.

- Cân phân tích của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chính xác 0,1mg.

- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu

 Dụng cụ:

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc, ống nghiệm.

- Pipet paster các loại: 10; 20; 100; 200; 5000 µL.

- Các lọ Falcon 15ml để đựng dung dịch chuẩn.

- Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm.
2.4. Các phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết bị

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền [9].

Thông thường, đối với các quá trình sắc kí, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3.

Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Với các quá trình sắc ký, giá trị LOD được xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10.

- Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ x_i khi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, bằng cùng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn. Do vậy còn gọi là độ chính xác trong phòng thí nghiệm [9].

- Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) theo các công thức sau:

Trong đó:

- S_i là diện tích của pic điện di thứ i

- S_tb là diện tích trung bình của n lần phân tích

- n là số lần phân tích lặp lại

2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng phương pháp xác định độ thu hồi [9].

Độ thu hồi (H):

Trong đó:

H: hiệu suất thu hồi (%)

C_tt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu được (tính theo đường chuẩn)

C_lt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn thêm vào.

Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trước khi xử lý mẫu thì sẽ cho độ đúng của phương pháp, còn nếu chất chuẩn được thêm vào trước khi bơm vào thiết bị CE thì sẽ cho độ đúng của thiết bị.

Các dung dịch sử dụng để lập đường chuẩn có nồng độ trong khoảng 5÷120 với MA và 10÷140ppm với MDA, MDAM, MDEA và được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc ban đầu. Mỗi dung dịch được bơm 3 lần và thực hiện quá trình điện di trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc với các điều kiện tối ưu như sau:

• 
  Mao quản silica đường kính trong ID = 50 µm, tổng chiều dài: 60cm (chiều dài hiệu dụng 53cm).
  
• 
  Phương pháp bơm mẫu: Thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10 cm.
  
• 
  Thời gian bơm mẫu: 45 s
  
• 
  Dung dịch đệm điện di: Arg/Ace (10 mM) pH = 4,5.
  
• 
  Thế tách: 10 kV
  
• 
  Giá trị diện tích pic trung bình là kết quả được sử dụng để lập đường chuẩn.
  

Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f = 5, độ tin cậy 95% có t = 2,57, kết hợp với các giá trị a, b, S_a, S_b, S_y của các chất từ phần mềm origin 6.1 ta có phương trình hồi quy của các chất phân tích:

Từ các kết quả trên cho thấy hệ số tương quan R² của các chất phân tích đều lớn hơn 0,99 đồng thời giá trị P _value<0,05 chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính.

Trong phương trình hồi quy y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi không có chất phân tích thì không có tín hiệu. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a ≠ 0.Nếu giá trị a khác 0 có ý nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích mắc sai số hệ thống.Vì vậy, trước khi sử dụng đường chuẩn cho chất phân tích công cụ thì cần kiểm tra sự khác nhau giữa giá trị a và 0 có ý nghĩa thống kê không.

* Kiểm tra a với giá trị 0:

Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình y = a + bx được viết thành y = b'x. Thay các giá trị x_i, y_i vào phương trình y = b'x ta sẽ được các giá trị b^’_i và tính

;

Phương sai của hai phương trình được tính như sau: