Bảng 3.3. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn MA, MDA, MDMA, MDEA

Chất		S2y	S'2y	Ftính	Fbảng
MA	1,9380	1,0123	4,3963	4,3429	4,3874
MDA	0,9906	0,7836	3,3527	4,2786	4,3874
MDMA	1,2889	1,0730	2,6185	2,4404	4,3874
MDEA	1,2813	3,3513	9,4132	2,8088	4,3874

Từ kết quả trên cho thấy F_tính< F_bảng nghĩa là sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê hay phương pháp không mắc sai số hệ thống.

 Giới hạn phát hiện (LOD) của thiết bị đo

Giá trị LOD [9] là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Có thể xác định LOD của phương pháp bằng nhiều cách khác nhau như: dựa trên độ lệch chuẩn, dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N), hoặc dựa trên đường chuẩn. Phương pháp điện di mao quản sử dụng công cụ có đường nhiễu nền nên thường xác định LOD của phương pháp dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) theo bảng:

Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của MA, MDA, MDMA, MDEA xác định bằng phương pháp điện di mao quản CE-C⁴D

Nồng độ (ppm)	Chất	Chiều cao pic (S) (mV)	Tín hiệu nhiễu đường nền (N) (mV)	S/N
1,0	MA	0,5019	0,1235	4,06
2,5	MDA	0,3991		3,23
2,5	MDMA	0,4803		3,89
2,5	MDEA	0,4304		3,49
0,5	MA	0,4825	0,1528	3,15
1,0	MDA	-		-
1,0	MDMA	-		-
1,0	MDEA	-		-

Như vậy, giới hạn phát hiện xác định được từ thực nghiệm dựa trên tỷ số S/N của MA là 0,5 ppm và của các chất MDA, MDMA, MDEA là 2,5 ppm.

 Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng là nồng độ của chất phân tích cho tỷ lệ tín hiệu/nền bằng 10. Từ đó ta có giới hạn định lượng của MA là 1,7 ppm và của các chất MDA, MDMA, MDEA là 8,3 ppm. Khoảng tuyến tính của các chất phân tích có thể mở rộng hơn nữa. Tuy nhiên, với đối tượng mẫu sinh học (mẫu nước tiểu), hàm lượng của các chất phân tích tương đối nhỏ và để đảm bảo độ phân giải tốt giữa các chất phân tích nên chúng tôi không tiếp tục khảo sát sự tuyến tính ở mức nồng độ cao hơn nữa [9].

Như vậy, chúng tôi xác định được khoảng tuyến tính của các chất phân tích như trong bảng 3.5 dưới đây:

Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của MA, MDA, MDMA, MDEA

Chất phân tích	Khoảng tuyến tính (ppm)	LOD (ppm)	LOQ (ppm)
MA	1,7 - 60	0,5	1,7
MDA	8,3 - 120	2,5	8,3
MDMA	8,3 - 120	2,5	8,3
MDEA	8,3 - 120	2,5	8,3

3.2.2. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) của thiết bị

Để đánh giá độ chụm [9] của thiết bị, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại của MA, MDA, MDMA và MDEA ở 3 mức nồng độ khác nhau. Mỗi mức nồng độ được tiến hành với 7 lần bơm mẫu độc lập. Kết quả thu được như sau:

Các kết quả trong bảng cho thấy, ở cả 3 mức nồng độ đều có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 3 % cho thấy thiết bị phân tích có độ lặp lại tốt.

Trong kỹ thuật chiết lỏng-lỏng việc lựa chọn được dung môi là vô cùng quan trọng. Để có được kết quả chiết tốt, dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu, hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết được triệt để. Dựa trên cơ sở này và tham khảo các tài liệu [1,7], chúng tôi đã lựa chọn 3 hệ dung môi sau để khảo sát:

Dung môi 1: Cloroform/isopropanol(9/1v/v)

Dung môi 2: Diclometan/ isopropanol (9/1 v/v)

Dung môi 3: Etyl axetat

Kết quả thu được được thể hiện trong hình 3.5 và bảng 3.10:

Từ kết quả trên ta thấy etyl acetat là dung môi cho hiệu quả chiết tốt nhất, hiệu suất thu hồi từ 78-102%. Ngoài ra, etyl acetat lại dễ bay hơi, không độc hại rất thuận lợi cho quá trình chiết nên chúng tôi lựa chọn dung môi này cho các khảo sát tiếp theo.

Hệ số phân bố của dung môi chiết phụ thuộc vào độ pH của dung dịch vì vậy sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của quá trình chiết về độ thu hồi cũng như khả năng làm sạch, làm giàu mẫu. Mà các chất phân tích có pK_a trong khoảng 9,7 - 9,9, vì thế chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường chiết đến hiệu suất chiết trong khoảng pH xung quanh giá trị pK_a, cụ thể là từ 7 đến 11, sử dụng NH₄OH để điều chỉnh pH. Kết quả được thể hiện trong hình 3.6 và hình 3.7:

Từ kết quả trên ta thấy, tại pH từ 8-10 cho hiệu quả chiết tốt đối với tất cả các chất phân tích.Trong đó, hiệu suất thu hồi tại pH=9 là cao nhất do vậy chúng tôi lựa chọn pH =9 là pH chiết tối ưu.

Thể tích dung môi chiết ảnh hưởng đến chất lượng chiết mẫu. Nếu lượng dung môi ít thì hiệu quả chiết không cao, còn nếu lượng dung môi quá nhiều sẽ không làm tăng hiệu quả chiết, thậm chí sẽ gây khó khăn trong quá trình cô đuổi dung môi và tốn kém khi phân tích đồng thời nhiều mẫu. Việc khảo sát thể tích dung môi chiết được thực hiện với 4 mức thể tích dung môi etyl axetat khác nhau là 1ml, 2ml, 3ml, 4ml và được chiết lặp 2 lần. Kết quả thu được được thể hiện trong hình 3.8 và hình 3.9:

Kết quả cho thấy thể tích dung môi chiết càng lớn thì hiệu suất thu hồi chất càng tốt. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi khi sử dụng 3ml và 4ml dung môi etyl axetat đều cao và tăng không đáng kể nên chúng tôi lựa chọn thể tích dung môi chiết etyl axetat là 3ml cho các thí nghiệm tiếp theo.

Như vậy, quy trình chiết lỏng – lỏng tối ưu như sau:

Lấy 5 ml mẫu nước tiểu vào ống nghiệm có nắp xoáy; kiềm hóa mẫu về pH = 9 bằng dung dịch NH₄OH 25% (kiểm tra bằng giấy quỳ); chiết mẫu bằng 3 ml etyl axetat, lắc trong vòng 10 phút; ly tâm cho tách lớp; hút lớp etyl axetat (lớp trên), đuổi dung môi bằng dòng khí N₂, hòa tan cặn chiết với lượng metanol thích hợp (100µL) rồi phân tích trên thiết bị CE-C⁴D. Với quy trình này, giới hạn phát hiện đạt được với MA là 10ppb, với MDA, MDMA, MDEA là 50ppb.

*Để đánh giá độ đúng của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết mẫu trắng đã thêm chuẩn ở 3 mức độ với quy trình chiết lỏng – lỏng tối ưu như đã nêu trong mục 3.3.3. Cặn chiết được hòa tan vào 100µl MeOH rồi tiến hành thêm chuẩn hỗn hợp chất trước khi bơm mẫu vào thiết bị CE. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần và lấy kết quả diện tích pic trung bình, kết quả được trình bày ở bảng 3.11 đến bảng 3.14: