Tổ chức y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm
tải về 361.36 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.3. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR
- 3.4. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR
3.2. Độ nhạy của kỹ thuật PCRPhản ứng PCR gồm hai lần chạy được thực hiện với mẫu chứng dương plasmid có nồng độ khác nhau: 101, 102, 103, 104 bản sao/µl và sử dụng 10 µl để điện di trên gel agarose 1%. 
Hình 3.10. Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai vòng trên vi khuẩn C.trachomatis Kết quả điện di (hình 3.10) cho thấy phản ứng dương tính (quan sát được các băng DNA sau khi nhuộm ethidium bromide) khi trong mẫu có từ 10 bản sao plasmid trở lên. Dựa trên kết quả đánh giá về độ nhạy của kỹ thuật PCR, chúng tôi lựa chọn nồng độ DNA chuẩn để làm chứng dương cho các phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis trong mẫu bệnh phẩm là 101. Sử dụng chứng dương ở nồng độ này sẽ làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm do khuếch tán sản phẩm PCR lần 1 trong quá trình chuyển sản phẩm khuếch đại lần 1 sang tuýp thứ hai. Độ nhạy này thuận lợi cho thực tế phát hiện bệnh vì số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm có thể thấp. Tuy vậy so với nghiên cứu của Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini và Esteban Serra, phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 và KL1/KL2) làm mồi có thể phát hiện ít hơn 10 EB mỗi phản ứng trong các mẫu sinh học khác nhau, độ nhạy trong phản ứng của chúng tôi chưa cao bằng. Do vậy chúng tôi đề xuất các thử nghiệm PCR trong các điều kiện nghiêm ngặt hơn nhằm tăng giá trị độ nhạy. 3.3. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCRPhản ứng PCR sử dụng cặp mồi KL1, KL2 được thực hiện với các mẫu DNA của vi khuẩn Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci và các mẫu DNA có sẵn trong phòng thí nghiệm như: mẫu DNA người, Escherichia Coli, Mycobacteria Tuberculosis, Hepatitis B virus, Human Papilloma virus. Các phản ứng sau khi thực hiện được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1% đều cho kết quả âm tính. Điều này chứng tỏ độ đặc hiệu cao 100% của phản ứng PCR, không khuếch đại sản phẩm của các đối tượng khác kể cả các loài Chlamydia khác. 3.4. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCRPhản ứng hai vòng là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. Tuy nhiên khả năng ngoại nhiễm cũng rất lớn. Để giảm thiểu nguy cơ ngoại nhiễm, chúng tôi sử dụng bốn phòng riêng biệt, một để pha mix, một để chuẩn bị mẫu và PCR lần 1, một tạo phản ứng PCR lần 2 và một phòng điện di. Trong các phản ứng chúng tôi sử dụng dUTP thay thế cho dCTP đồng thời sử dụng enzyme Uracyl-N-Glycosylase (UNG) nồng độ 0,05U. Enzyme này có tác dụng phân cắt các liên kết N- glycosylic giữa Uracyl và glucose của các sản phẩm ngoại nhiễm có chứa dUTP trong phản ứng thành các dUTP tự do, vô hiệu hoá amplicon nhiễm từ những đợt PCR trước đó do vậy sẽ tránh được kết quả dương tính giả. Do vậy, trước khi thực hiện các chu kỳ khuếch đại trong chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm ở 37ºC trong 15 phút với enzyme UNG để phá các trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ các đợt trước. Các chu trình khuếch đại tiếp theo sẽ làm bất hoạt hoạt tính của UNG với nhiệt độ trên 55ºC. Sau khi chạy xong các chu kỳ khuếch đại, ủ mẫu ở 72ºC trong thời gian 20 phút để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính của UNG, không gây cản trở cho việc đọc kết quả PCR. Kết quả dương tính giả còn được loại trừ bằng một chứng âm thực hiện đồng thời với xét nghiệm trên mẫu nhưng thay DNA khuôn bằng nước khử ion vô trùng. Kết quả âm tính giả cũng được hạn chế đến mức thấp nhất vì phản ứng có độ nhạy cao, phát hiện được kết quả dương tính khi có mặt 10 EB. Kết quả xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm được thể hiện ở hình 3.11. 
Hình 3.11. Kết quả xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm. NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Giếng số 1,3,4: Mẫu bệnh phẩm dương tính Giếng số 2: Mẫu bệnh phẩm âm tính Giếng số 5: Chứng dương M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis trong số bệnh nhân đến khám tại phòng khám Sản phụ khoa, bệnh viện Đại học Y Thái Bình thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm C.trachomatis Trong số 217 bệnh nhân có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011 có 80 người có kết quả dương tính với C.trachomatis chiếm tỷ lệ 36.9%. Kết quả này cao hơn nghiên cứu của Trần Thị Lợi trên đối tượng viêm âm đạo, cổ tử cung năm 1999 có tỷ lệ 32.5% [8]; tại bệnh viện da liễu thành phố Hồ Chí Minh năm 2008 với xét nghiệm PCR tỷ lệ này là 35.7% [6]; tại bệnh viên phong da liễu Quy Hòa 12.1% [5]. Trong các nghiên cứu này tỷ lệ thấp nhất là tại bệnh viên phong da liễu Quy Hòa có thể do cỡ mẫu còn ít. Kết quả này cũng cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Farhad B. Hashemi và cộng sự tại Iran năm 2006 [16]. Tuy nhiên một nghiên cứu ở Sóc Trăng trên đối tượng phụ nữ mại dâm tỷ lệ dương tính với C.trachomatis là 48.4% [3], cao hơn nghiên cứu của chúng tôi. Kết quả xét nghiệm trên chưa phản ánh được toàn bộ quần thể vì còn có những đối tượng nhiễm bệnh nhưng không có biểu hiện viêm nhiễm nên không đi khám, và xét nghiệm này lần đầu tiên được áp dụng tại Thái Bình. Vì vậy, với kết quả dương tính cao như trên, chúng tôi đề xuất việc triển khai xét nghiệm vi khuẩn C.trachomatis trong bệnh viện Đại học Y Thái Bình trên các đối tượng nữ có và không có biểu hiện viêm nhiễm sinh dục nhằm kiểm soát sự lây nhiễm vi khuẩn này qua đường tình dục. Đồng thời chúng tôi đề nghị tiến hành nghiên cứu thêm trên cỡ mẫu lớn hơn để khẳng định kết quả. Tiếp đó chúng tôi tiến hành thống kê số bệnh nhân theo nhóm tuổi. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi Kết quả cho thấy nhóm dưới 25 tuổi có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6%. Nghiên cứu của tác giả Bulhak Koziol V và cộng sự [33] tại một tỉnh của Balan cho thấy tỷ lệ dương tính với vi khuẩn này là 39.5%, gần tương đương với kết quả của chúng tôi. Sự khác biệt về tỷ lệ dương tính giữa nhóm dưới 25 tuổi và trên 35 tuổi là có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Tương tự như vậy, sự khác biệt giữa nhóm dưới 25 và từ 25- 35 tuổi cũng có ý nghĩa thống kê (p<0.05). Trong khi đó,khác biệt giữa nhóm 25- 35 tuổi và trên 35 tuổi không có ý nghĩa thống kê (p>0.05) Trong số bệnh nhân dương tính có những đối tượng chưa kết hôn nhưng đã quan hệ tình dục, nên khả năng bị dính tắc vòi trứng dẫn tới vô sinh, chửa ngoài tử cung khi lập gia đình là rất cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Đặc biệt trong số này có cả sinh viên đại học và cao đẳng. Điều này cho thấy nhận thức về bệnh lây truyền qua đường tình dục nói chung và bệnh do C.trachomatis nói riêng chưa được quan tâm nhiều trong giới trẻ tại Thái Bình. Chúng tôi đề xuất việc tuyên truyền nhận thức bệnh lây truyền qua đường tình dục do C.trachomatis cho giới trẻ tại Thái Bình trong thời gian tới. Thống kê số bệnh nhân theo khu vực thành thị và nông thôn chúng tôi thu được kết quả theo bảng 3.7.
Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực Kết quả này cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis trong nghiên cứu tại Thái Bình ở nông thôn cao hơn ở thành phố, tỷ lệ khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Đồng thời chúng tôi thấy tỷ lệ bệnh nhân dương tính tại nông thôn là 37.8% cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Kirkwood và cộng sự tại Anh (1999) (tỷ lệ là 12.5%) [10]. Điều này có thể giải thích do số người khám bệnh đến từ nông thôn trong nghiên cứu của chúng tôi lớn hơn so với nghiên cứu trên. Qua tư vấn chúng tôi thấy phần lớn các phụ nữ đến khám đều không rõ vi khuẩn C.trachomatis gây bệnh gì và để lại hậu quả ra sao nếu không điều trị kịp thời. Do vậy chúng tôi đề nghị tuyên truyền các thông tin liên quan đến bệnh tại tỉnh nhà để người dân được biết.
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 361.36 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|