Tổ chức y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
tải về 361.36 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.1.2. Thời gian nghiên cứu: từ 01/04/2011.
- 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- 2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm
- 2.2.2.2. Xử lý mẫu
- 2.2.2.3. Tách chiết ADN
- 2.2.2.4. Tối ưu hóa phản ứng PCR
- 2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR
- 2.2.2.7. Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011
- 2.2.2.8. Điện di, phân tích kết quả
- 2.2.3. Xử lý số liệu
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU2.1.1. Đối tượng nghiên cứu- Mẫu DNA vi khuẩn Chlamydia trachomatis do Viện Công nghệ sinh học- Viện Khoa học Việt Nam cung cấp. - Các bệnh nhân nữ trong độ tuổi sinh sản (15-49 tuổi) có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại phòng khám Sản phụ khoa - Bệnh viện Đại học Y Thái Bình trong thời gian từ 01/04/2011 đến 10/2011. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu: từ 01/04/2011.2.1.3. Địa điểm nghiên cứu+ Lấy mẫu dịch phết cổ tử cung tại phòng khám Sản phụ khoa - Bệnh viện Đại học Y Thái Bình. + Chuẩn quy trình kỹ thuật, xử lý mẫu, tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫuPhương pháp chọn mẫu Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Bệnh nhân trong độ tuổi sinh sản, đã từng quan hệ tình dục. Được khám và chẩn đoán là viêm âm đạo, cổ tử cung. Đồng ý tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân đang trong giai đoạn kinh nguyệt, bị rong kinh, rong huyết. Bệnh nhân đã từng điều trị kháng sinh trong vòng 1 tháng trước đó. Không đồng ý tham gia nghiên cứu. Những bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu sẽ được lấy mẫu dịch phết cổ tử cung để tiến hành làm xét nghiệm PCR phát hiện Chlamydia trachomatis tại Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình.
Để xác định cỡ mẫu cho việc ước tính tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở những phụ nữ viêm cổ tử cung chúng tôi sử dụng công thức: 
Trong đó: n là cỡ mẫu, m là độ sai số, p là tỉ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở phụ nữ viêm cổ tử cung. Với p = 17% (theo nghiên cứu của Farhad B. Hashemi và cộng sự [16]) và lựa chọn giá trị độ sai số m = 0,05 thì cỡ mẫu n tối thiểu là 217 bệnh nhân.
2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫuNhững bệnh nhân được lựa chọn tham gia nghiên cứu đều được thăm khám bởi các bác sĩ Sản phụ khoa để xác định tình trạng viêm âm đạo, cổ tử cung trước khi lấy mẫu. Dùng tăm bông lau sạch dịch tiết cổ tử cung. Dùng tăm bông tiếp theo đưa sâu vào ống cổ tử cung 2 cm, xoay tăm bông và miết tăm bông vào thành ống cổ tử cung từ 15 đến 30 giây. Khi kéo tăm bông ra không chạm vào vách âm đạo. Mẫu phết cổ tử cung được giữ trong tuýp Falcol 15 ml có chứa 2 ml dung dịch 2SP (2-sucrose-phosphate transport medium), bảo quản ở 4oC và đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2- 3 giờ và thực hiện phản ứng PCR trong vòng 24 giờ. Tại phòng thí nghiệm, bệnh phẩm được chia nhỏ vào hai tuýp eppendorf 1.5 ml (1ml/tuýp), một tuýp được sử dụng để tách chiết DNA, tuýp còn lại được bảo quản ở -70oC. 2.2.2.2. Xử lý mẫu- Lấy 500 µl bệnh phẩm cho vào tuýp eppendorf 1.5 ml, bổ sung 500 µl dung dịch TTE, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy. - Bổ sung 500 µl dung dịch PBS, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy. 2.2.2.3. Tách chiết ADNTuýp trên được sử dụng để tách chiết theo phương pháp Boom [14]. Bước 1: Phá tế bào giải phóng DNA - Bổ sung 1000 µl dung dịch L6, vortex, bổ sung 30 µl SiO2, vortex đều, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. Bước 2: Tinh sạch DNA - Bổ sung 1000 µl dung dịch L2, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. - Làm lại bước trên. - Bổ sung 1000 µl dung dịch ethanol 70% lạnh, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. - Làm lại bước trên. - Bổ sung 1000 µl dung dịch acetone 100%, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. - Làm khô cặn bằng cách sấy ở 60oC trong 10 phút, mở nắp eppendorf. Bước 3: Thu hồi DNA - Bổ sung 50 µl TE, ủ ở 60oC trong 10 phút, đóng nắp eppendorf. Ly tâm 13.000rmp/30s. Hút dịch nổi sang một eppendorf mới, ghi tên dán nhãn. - Làm lại bước trên. Dịch nổi chứa DNA thu được bảo quản ở -20oC sử dụng chạy PCR. 2.2.2.4. Tối ưu hóa phản ứng PCRTại các phòng thí nghiệm khác nhau, phản ứng PCR được thực hiện trên các máy luân nhiệt của các hãng khác nhau, đội ngũ cán bộ có trình độ khác nhau và sử dụng hoá chất của nhiều hãng. Vì vậy việc tối ưu hoá phản ứng trong từng phòng thí nghiệm là điều cần thiết để có một kết quả PCR chính xác, giảm thiểu sai sót và tránh lãng phí hoá chất không cần thiết. Tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình, phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Mastercycler C1000 của Biorad. Thành phần phản ứng gồm: Master Mix (MgCl2, Taq polymerase, buffer), primer(reverse và foward), DNA khuôn. Chúng tôi sử dụng hai cặp mồi (theo khuyến cáo của CDC) để cho kết quả có độ chính xác cao. Primer cho phản ứng PCR đầu tiên chúng tôi dùng cặp mồi KL5 và KL6 khuếch đại đoạn có kích thước 288 bp trên cryptic plasmid của vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Primer này có công thức như sau:
Primer cho phản ứng PCR thứ 2 chúng tôi dùng cặp mồi KL1 và KL2 khuếch đại đoạn có kích thước 241 bp trên cryptic plasmid của vi khuẩn Chlamydia trachomatis, nằm trong đoạn 288 bp trên, với công thức như sau:
Để tối ưu hóa phản ứng chúng tôi tiến hành thử nghiệm PCR trong các nồng độ mồi khác nhau, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2, số chu kỳ thích hợp trong mỗi phản ứng. Trong mỗi phản ứng chúng tôi sử dụng enzyme UNG để khử các amplicon ngoại nhiễm. Nồng độ MgCl2 Trong các thành phần buffer của phản ứng PCR, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2. Việc tăng nồng độ MgCl2 quá cao làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu nhưng nếu thiếu lại dẫn tới tình trạng lượng sản phẩm PCR thấp. Hơn nữa hóa chất do các hãng khác nhau cung cấp sẽ cho nồng độ MgCl2 thích hợp khác nhau, ở đây chúng tôi dùng MgCl2 nồng độ gốc 25 mM của Fermentas. Với cặp mồi KL1/KL2, phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ MgCl2 khác nhau để lựa chọn ra nồng độ thích hợp nhất nhằm làm tăng hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi loại mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAG-TTACTAAGA-3) và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 0.7 mM; 0.9 mM; 1.1 mM; 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Tiếp đó chúng tôi tiến hành tối ưu hóa nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi loại mồi KL5 (5-TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGT-CCTTCCTAAAAGAGCTA-3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.1 mM; 2.3 mM; 2.5 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Nồng độ mồi Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Trong phản ứng PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và phản ứng PCR càng đặc hiệu. (2) Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng được chuẩn bị trong các nồng độ mồi khác nhau từ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 và 1 pmol/µl. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.Với cặp mồi KL1/KL2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi khác nhau: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µl, trong mỗi phản ứng có chứa 1 µl sản phẩm PCR lần 1. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút là 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5- 1°C). Đối với các primer có Tm cao hoặc tự bắt cặp, có cấu trúc vòng thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C). Với cặp mồi KL1/LK2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ khác nhau từ 50 đến 63ºC. Trong thể tích phản ứng 25 µl có 0.05 U UNG, các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-63ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 50-63ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Với cặp mồi KL5/LK6, phản ứng PCR cũng được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 54 đến 610C. Trong thể tích phản ứng 25 µl, các loại mồi xuôi và mồi ngược, 0.05 U UNG, các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 54-61ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 54-610C, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Thời gian gắn mồi: Tùy theo kích thước và tỷ lệ GC có trong mồi, thời gian gắn mồi thích hợp có thể khác nhau. Với hai cặp mồi KL1/KL2 và KL5/KL6 chúng tôi tiến hành phản ứng PCR ở các thời gian gắn mồi khác nhau là: 20s, 30s, 40s, 50s và 60s. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 0.05 U UNG, các mồi xuôi và mồi ngược với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s, 50s và 60s. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 20s, 30s, 40s, 50s hoặc 60s ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Số chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, trong đó số chu kỳ của từng phản ứng được thay đổi. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; các loại mồi. Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Số chu kỳ của từng phản ứng thể hiện trong bảng dưới đây:
2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCRSử dụng mẫu DNA vi khuẩn C.trachomatis được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi KL5/KL6, đoạn DNA được khuếch đại có kích thước 288 bp thuộc trình tự plasmid của vi khuẩn C.trachomatis. Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được chèn vào vector pJet1.2/blunt (CloneJETTM PCR Cloning kit - Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis được biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng Top 10F’nuôi qua đêm. Sau đó plasmid tái tổ hợp được tinh sạch bằng từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kít GeneJETTM plasmid miniprep kit – Fermentas. Xác định nồng độ plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng cách đo khả năng hấp thụ bước sóng 260nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Dựa vào nồng độ plasmid tái tổ hợp có thể tính được số bản sao plasmid trên một đơn vị thể tích theo công thức [35]: N= (6.022*1023)*C/(650*109*3262) Trong đó: 6.022*1023 là số bản copi plasmid trong 1 mole (định luật Avogadro) C là nồng độ plasmid (ng) 650 là khối lượng 1 mole của một cặp base (gr) = 650*109ng 3262 là chiều dài của plasmid (bao gồm plasmid có kích thước 2974 bp và đoạn chèn kích thước 288 bp). Sau đó, mẫu plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis được pha loãng thành các dung dịch có các nồng độ từ 1010, 109, 108, 107,... đến 101 bản sao plasmid/µl và sử dụng làm mẫu chuẩn để đánh giá độ nhạy của phản ứng. Phản ứng PCR được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X và các loại mồi, 0.05 U UNG, thực hiện với mẫu chứng dương plasmid có nồng độ khác nhau: 101, 102, 103, 104 bản sao/µl và sử dụng 10 µl để điện di trên gel agarose 1%. Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Sử dụng các mẫu DNA có sẵn trong phòng thí nghiệm để tiến hành phản ứng PCR kiểm tra xem có hiện tượng phản ứng chéo xảy ra hay không. Phản ứng PCR được thực hiện với các mẫu DNA của Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci và các mẫu DNA có sẵn trong phòng thí nghiệm như: mẫu DNA người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Hepatitis B virus, Human Papilloma virus. 2.2.2.7. Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011Các mẫu bệnh phẩm thu thập đúng tiêu chuẩn chọn lựa sẽ được tiến hành phản ứng PCR theo quy trình chuẩn ở trên. 2.2.2.8. Điện di, phân tích kết quảChúng tôi sử dụng 10 µl sản phẩm phản ứng PCR để điện di trên gel agarose 1%, nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml, chụp ảnh và phân tích kết quả. - Chuẩn bị gel Agarose: Hòa tan 1 g agarose trong 100 ml TBE 1X bằng lò vi sóng (2-3 phút). Để nguội agarose đến khoảng 50-60ºC rồi đổ vào khay đổ gel có cài sẵn răng lược. Đợi khoảng 20-30 phút cho gel đông hoàn toàn mới được gỡ răng lược ra. - Điện di sản phẩm PCR Sử dụng 10 l sản phẩm PCR và marker để chạy điện di trong dung dịch TBE 1X, hiệu điện thế 100 V với thời gian là 30 – 45 phút. Sau khi điện di xong, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide 0.5 g/ml từ 5-10 phút. Rửa bản gel dưới vòi nước chảy trong vòng 30 giây. - Chụp ảnh gel trên hệ thống UVP - Phân tích kết quả: + Mẫu chứng dương phải có vạch DNA có kích thước đúng khi so sánh với thang DNA chuẩn (241 bp) + Mẫu chứng âm phải không hiện vạch DNA. + Mẫu bệnh phẩm dương tính là mẫu có hiện vạch DNA tương đương với vạch DNA của mẫu chứng dương. + Mẫu bệnh phẩm âm tính là mẫu không có vạch DNA tương đương với mẫu chứng dương.
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 361.36 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
