Tổ chức y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5. Trong quá trình phân tích số liệu, chúng tôi sử dụng các test t-test, F-test để kiểm định ý nghĩa thống kê

tải về 361.36 Kb.

trang	5/7
Chuyển đổi dữ liệu	19.09.2016
Kích	361.36 Kb.
	#32268

1 2 3 4 5 6 7

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5. Trong quá trình phân tích số liệu, chúng tôi sử dụng các test t-test, F-test để kiểm định ý nghĩa thống kê.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phát hiện Chlamydia trachomatis

Tại các phòng thí nghiệm khác nhau, phản ứng PCR được thực hiện trên các máy luân nhiệt của các hãng khác nhau, đội ngũ cán bộ có trình độ khác nhau và sử dụng hoá chất của nhiều hãng. Vì vậy việc tối ưu hoá phản ứng trong từng phòng thí nghiệm là điều cần thiết để có một kết quả PCR chính xác, giảm thiểu sai sót và tránh lãng phí hoá chất không cần thiết.

Tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình, phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Mastercycler C1000 của Biorad.

Để một phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt trong thời gian ngắn nhất, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR nhằm tối ưu các điều kiện (nồng độ mồi, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, số chu kỳ lặp lại và nồng độ MgCl₂) thích hợp đối với từng cặp mồi.

3.1.1. Nồng độ MgCl₂

Trong các thành phần buffer của phản ứng PCR, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl₂. Việc tăng nồng độ MgCl₂ quá cao làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu nhưng nếu thiếu lại dẫn tới tình trạng lượng sản phẩm PCR thấp. Hơn nữa hóa chất do các hãng khác nhau cung cấp sẽ cho nồng độ MgCl₂ thích hợp khác nhau, ở đây chúng tôi dùng MgCl₂nồng độ gốc 25 mM của Fermentas.

Để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phản ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl₂ thích hợp nhất. Nồng độ MgCl₂ có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion Mg²⁺ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi. Nồng độ MgCl₂ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl₂quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR.

Với cặp mồi KL1/KL2, phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ MgCl₂ khác nhau để lựa chọn ra nồng độ thích hợp nhất nhằm làm tăng hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu. Phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAG-TTACTAAGA-3) và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl₂thay đổi từ 0.7mM; 0.9mM; 1.1mM; 1.3mM; 1.5mM; 1.7mM. . Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả phản ứng được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl₂với cặp mồi KL1/KL2

M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100bp

Giếng số 1 đến giếng số 6 nồng độ MgCl₂ thay đổi từ 1,7 mM đến 0,7 mM

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.1) cho thấy, ở các nồng độ MgCl₂ khác nhau thì phản ứng PCR cho kết quả khác nhau. Ở nồng độ 1.5 mM và 1.7 mM cho kết quả nét nhất (giếng số 1 và giếng số 2) trong đó giếng số 2 cho băng gọn nét hơn. Từ kết quả này chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl₂ là 1,5 mM cho các phản ứng PCR ứng dụng trong phát hiện sự có mặt của vi khuẩn C.trachomatis từ mẫu bệnh phẩm.

Tiếp đó chúng tôi tiến hành tối ưu hóa nồng độ MgCl₂với cặp mồi KL5/KL6. Phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi mồi KL5 (5-TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGT-CCTTCCTAAAAGAGCTA-3),0.05 U UNG và nồng độ MgCl₂thay đổi từ 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.1 mM; 2.3 mM; 2.5 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả thể hiện ở hình 3.2.

Hình 3.2. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl₂với cặp mồi KL5/KL6

NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)

Giếng số 1 đến số 8: nồng độ MgCl₂ thay đổi từ 1,3 mM đến 2,5 mM

M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp

Trong hình trên chỉ có nồng độ 2.0 và 2.1 mM (giếng số 5 và số 6) là cho kết quả rõ nét nhưng nét nhất là ở nồng độ 2.1 mM (giếng số 6). Vì vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl₂ là 2.1 mM cho các phản ứng PCR ứng dụng trong phát hiện sự có mặt của vi khuẩn C.trachomatis từ mẫu bệnh phẩm khi sử dụng cặp mồi KL5/KL6.

3.1.2. Nồng độ mồi

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. (2) Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi.

Với cặp mồi KL5/KL6, thành phần phản ứng được chuẩn bị có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl₂; 0.05 U UNG, các nồng độ mồi khác nhau từ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 và 1 pmol/µl. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di sản phẩm PCR thể hiện trên hình 3.3.

Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ mồiKL5/KL6

NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)

Giếng số 1 đến số 8: sản phẩm PCR với nồng độ mồi thay đổi từ 0,2 đến 1 pmol

M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp

Trong các kết quả trên chỉ có giếng số 2 cho kết quả nét nhất tương ứng với nồng độ 0.4 pmol/µl, vì vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ này cho phản ứng PCR.

Với cặp mồi KL1/KL2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi khác nhau: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µl, trong mỗi phản ứng có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl_2,1 µl sản phẩm PCR lần 1, 0.05 U UNG. Các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-60ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.4) cho thấy: ở các nồng độ mồi khác nhau, phản ứng PCR cho các kết quả khác nhau.

Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ mồiKL1/KL2

NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)

Giếng số 1 đến số 4: sản phẩm PCR với nồng độ mồi thay đổi từ 0,1 đến 0,4 pmol

M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp

Nồng độ mồi 0.1 pmol/µl cho kết quả băng mờ và chưa rõ nét. Ở nồng độ 0.2 pmol/µl trở lên các băng sản phẩm PCR rõ nét. Tuy nhiên phản ứng PCR ở nồng độ 0.4 pmol/µl sản phẩm sau điện di cho băng có độ sáng rõ nét nhất. Thử nghiệm phản ứng với các nồng độ mồi cao hơn chúng tôi thấy không có sự khác biệt lớn giữa các băng điện di. Từ các kết quả của phản ứng PCR trên các nồng độ mồi khác nhau, chúng tôi lựa chọn nồng độ mồi KL1/KL2 tốt nhất là 0.4 pmol/µl.

3.1.3. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi

Nhiệt độ gắn mồi

Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng gradient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5°C). Đối với các primer có Tm cao hoặc tự bắt cặp, có cấu trúc vòng thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C).

Với cặp mồi KL1/LK2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ khác nhau từ 50°C đến 63°C, phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl₂; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-63ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 50-63ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.

Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. Kết quả điện di (hình 3.5) cho thấy, ở các nhiệt độ khác nhau phản ứng PCR cho kết quả khác nhau.

Hình 3.5. Ảnh diện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2

Trên ảnh điện di ở nhiệt độ 55ºC cho kết quả PCR tốt nhất, băng sản phẩm PCR có độ sáng rõ và nét nhất. Còn ở các nhiệt độ khác thì hiệu quả của phản ứng PCR không được tốt thể hiện qua các băng của sản phẩm PCR có độ sáng mờ và không rõ nét. Từ kết quả của phản ứng PCR được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau, phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi 55^oC.

Với cặp mồi KL5/LK6, phản ứng PCR cũng được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau. Ban đầu chúng tôi tiến hành thử nghiệm trong dải nhiệt từ 50ºC đến 61ºC thu được kết quả các băng điện di chỉ xuất hiện từ nhiệt độ 54ºC trở đi. Tiếp đó chúng tôi thử nghiệm phản ứng trong dải nhiệt độ từ 54ºC đến 61ºC, phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl₂; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 54-61ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 54-61^oC, 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.

Kết quả điện di (hình 3.6) cho thấy, ở nhiệt độ 59^oC cho kết quả PCR tốt nhất, băng sản phẩm PCR có độ sáng rõ và gọn nét nhất. Vậy chúng tôi chọn hiệu quả gắn mồi tốt nhất ở nhiệt độ 59ºC.

Hình 3.6. Ảnh diện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6

Thời gian gắn mồi

Thời gian gắn mồi cũng được chuẩn hóa trong các phản ứng PCR.

Với cặp mồi KL5/KL6 thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s 50s và 60s, phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl₂; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt : 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC; 20s, 30s, 40s 50s hoặc 60s ở 59⁰C; và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di cho thấy hiệu quả gắn mồi tốt nhất là ở 60s (hình 3.7).

Hình 3.7. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6

Với cặp mồi KL1/KL2 đầu tiên chúng tôi tiến hành thử nghiệm với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20, 30, 40, 50 và 60s, kết quả không có sự khác biệt lớn các băng điện di ở 50 và 60s. Do vậy chúng tôi kiểm tra lại thử nghiệm trong thời gian 20s, 30s, 40s. Phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl₂; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 20s, 30s, 40s ở 55⁰C, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ và một bước kéo dài trong 7 phút ở 72°C. Kết quả cho thấy hiệu quả gắn mồi ở 40s là nét nhất (hình 3.8). Do vậy, chúng tôi chọn thời gian gắn mồi cho KL1/KL2 là 40s trong phản ứng PCR thứ 2.

NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)

Hình 3.8. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2

3.1.4. Số chu kỳ

Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, số chu kỳ với từng cặp mồi được thay đổi để thu được kết quả tốt trong thời gian ngắn nhất. Phản ứng PCR vòng 1 được tiến hành với số chu kỳ là 20, 25 và 30 chu kỳ. Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl₂; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC; 1 phút ở 59ºC; và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.

Sau đó tiến hành phản ứng PCR vòng 2, phản ứng được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl₂; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 1 µl sản phẩm của phản ứng PCR vòng 1,0.05 U UNG theo từng chu kỳ trên. Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 40s ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ và một bước kéo dài trong 7 phút ở 72°C. Quan sát kết quả điện di trên hình 3.9.

Hình 3.9. Ảnh diện di kết quả tối ưu chu kỳ phản ứng

Giếng số 1 đến giếng số 3: 20 chu kỳ PCR lần 1 và 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần 2

Giếng số 4 đến giếng số 6: 25 chu kỳ PCR lần 1 và 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần 2

Giếng số 7 đến giếng số 9: 30 chu kỳ PCR lần 1 và 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần 2

Kết quả chúng tôi thấy ở giếng số 3, số 5 và số 7, với tổng số 50 chu kỳ của phản ứng PCR thì kết quả khếch đại tốt nhất là ở giếng số 5 (25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 và 25 chu kỳ PCR lần 2 với cặp mồi KL1/KL2). Giếng số 1 và số 2 hiệu quả khuếch đại thấp, không sử dụng. Các giếng khác cũng cho băng điện di rất rõ nét nhưng chúng tôi không sử dụng vì thời gian xét nghiệm sẽ quá dài. Giếng số 7 cho băng nhỏ hơn giếng số 6 có thể do thành phần nguyên liệu trong phản ứng đã cạn kiệt dẫn đến sự đứt gãy DNA trong 5 chu kỳ biến tính còn lại. Kết quả tương tự với giếng số 9 và số 8. Vì vậy chúng tôi lựa chọn 25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 và 25 chu kỳ PCR lần 2 với cặp mồi KL1/KL2 để thực hiện các phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn C. trachomatis. Với kết quả này chúng tôi đã rút ngắn thời gian tiến hành hai phản ứng PCR xuống còn 3 giờ.

Từ kết quả trên, chúng tôi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR về nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl₂ và số chu kỳ tối ưu nhất cho một phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Điều kiện tối ưu của kỹ thuật PCR về nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl₂ và nồng độ mồi được thể hiện qua các bảng sau:

Bảng 3.1: Thành phần phản ứng PCR vòng 1

Thành phần phản ứng PCR	Thể tích	Nồng độ
Mastermix 2X	12.5µl
H₂O khử ion vô trùng	4.4µl
MgCl₂ (mM)	2.1µl	2.1mM
Mồi KL5/KL6	1µl	0.4 pmol
UNG	0.05 µl	0.05 U
DNA template	5µl
Tổng	25µl

Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng 1

Nhiệt độ	Thời gian (phút : giây)	Số chu kỳ
37ºC	15:00	1
95ºC	10:00	1
94ºC	01:00	25
59ºC	01:00
72ºC	01:00
72ºC	20:00	1
4ºC	∞

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR vòng 2

Thành phần phản ứng PCR	Thể tích	Nồng độ
Mastermix 2x	12.5µl
H₂O khử ion vô trùng	9µl
Nồng độ MgCl₂ (mM)	1.5µl	1.5mM
Nồng độ mồi	1µl	0.4 pmol
PCR product	1µl
Tổng	25µl

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng 2

Nhiệt độ	Thời gian (phút : giây)	Số chu kỳ
95ºC	10:00	1
94ºC	01:00	25
55ºC	00:40
72ºC	01:00
72ºC	20:00	1
4ºC	∞

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường