Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32]

1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immu­noassays– EIAs)

Khi mẫu xét nghiệm được thêm vào màng, kháng nguyên của C.trachomatis sẽ gắn với kháng thể được phủ sẵn trên màng. Sau đó bổ sung kháng thể đặc hiệu với C.trachomatis liên kết với kháng nguyên đã được bắt giữ bởi kháng thể trên màng. Dung dịch enzyme được thêm vào sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu của C.trachomatis. Bước tiếp theo là rửa để loại bỏ các thành phần không gắn với màng. Bổ sung cơ chất đặc hiệu với enzyme vào màng. Nếu có kháng nguyên, cơ chất phản ứng với enzyme tạo sự thay đổi màu sắc phát hiện và đo được bằng máy quang phổ kế.

Xét nghiệm này có hiệu quả với quy mô sàng lọc lớn, không đòi hỏi vi khuẩn còn sống, rẻ tiền hơn nuôi cấy và yêu cầu kỹ năng xét nghiệm vừa phải. Tuy vậy nó có nhược điểm là không sử dụng được với nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp và âm đạo do giảm độ nhạy và độ đặc hiệu với các mẫu này, được sử dụng sàng lọc quần thể có tỷ lệ dương tính thấp (≤ 5%) [32]. Xét nghiệm này có độ nhạy thấp hơn NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào.

1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody- DFA)

Mẫu bệnh phẩm được thu thập, mẫu được đánh dấu tên và địa chỉ bệnh nhân. Sau đó, mẫu được phết nhẹ nhàng lên lam kính và được cố định ngay lập tức bằng methanol. Sau khi được làm khô trong không khí từ 2 đến 3 phút, lam kính được vận chuyển đến phòng thí nghiệm, nhuộm bằng kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis. Kháng thể liên kết đặc hiệu với C.trachomatis có trong mẫu. Tiếp đó là bước rửa để loại bỏ những kháng thể không liên kết. Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, mẫu dương tính C.trachomatis dạng cơ bản màu xanh táo tương phản với màu đỏ đất của tế bào.

Xét nghiệm áp dụng được cho nhiều loại mẫu khác nhau, không yêu cầu vi khuẩn còn sống, đòi hỏi kỹ năng xét nghiệm vừa phải, thích hợp chẩn đoán trên các đối tượng có nguy cơ cao. Sự thành công của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Có kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis, đủ kháng thể để kết hợp, kính hiển vi huỳnh quang chất lượng tốt. Kỹ thuật này không thích hợp cho số lượng mẫu lớn và đối tượng có nguy cơ thấp, độ nhạy thấp hơn NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào [32].

1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs).

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho sự phát hiện C.trachomatis [21]. Nhiều nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch quết cổ tử cung hoặc trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân với các cặp mồi trên plasmid, trên gen mã hóa protein màng hoặc trên rRNA. Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể giảm độ nhạy do sự có mặt các chất ức chế có trong mẫu hoặc không đủ độ nhạy để phát hiện mẫu chứa quá ít dạng cơ bản của vi khuẩn C. trachomatis. Do vậy có thể tạo ra sản phẩm âm tính giả. Theo Saiki và cộng sự (1985) [23], để phát hiện 25 ng DNA trên gel agarose nhuộm ethidium bromide sau 35 chu kỳ khuếch đại từ 10 phân tử ban đầu ở mẫu cần hiệu quả khuếch đại cao hơn 90%.

Nested PCR là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi thay vì một cặp mồi như kỹ thuật PCR cổ điển. Cặp mồi thứ hai được thiết kế nằm trong đoạn gen mà cặp mồi thứ nhất khuếch đại. Quá trình chạy PCR lần đầu không khác gì PCR thông thường. Sản phẩm của phản ứng PCR lần đầu sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai cùng với cặp mồi thứ hai. Kết quả sau hai lần PCR thu được sản phẩm đặc hiệu hơn nhiều. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện vi khuẩn ở mật độ rất thấp mà các phương pháp thông thường khó có thể phát hiện được (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu). Đây được xem là “tiêu chuẩn vàng” mới trong phát hiện vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm do độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó. Theo Pamela Cribb và cộng sự (2002) [22], xét nghiệm này có thể phát hiện DNA tương ứng với nhỏ hơn 10 dạng cơ bản (EB) của vi khuẩn C.trachomatis trong hỗn hợp phản ứng, cho phép phát hiện kết quả âm tính giả và đáp ứng được với sự thay đổi ở các phòng thí nghiệm khác nhau.

Mẫu được xử lý để tách DNA của C.trachomatis. Các thành phần của phản ứng PCR được thiết lập gồm primer, dNTP, Taq polimerase, MgCl2. Các primer liên kết với DNA đích đặc hiệu của C.trachomatis. Enzym Taq polymerase kéo dài mỗi trình tự DNA sử dụng các nucleotide tự do để tạo trình tự DNA bổ sung. Quá trình khuếch đại này xảy ra khi hỗn hợp phản ứng được ủ trong máy luân nhiệt. Mỗi chu kỳ làm tăng số lượng DNA đích theo hàm mũ. Sau khi khuếch đại, sản phẩm lần 1 được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Sau phản ứng PCR lần 2, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và phân tích trên hệ thống chụp ảnh gel .

Xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên mẫu nước tiểu (độ nhạy của mẫu này thấp hơn mẫu dịch phết), nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp và âm đạo.

Xét nghiệm này độ nhạy trên 90%, độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào, có ưu điểm là có thể áp dụng ở những nơi không có khả năng nuôi cấy, không đòi hỏi vi khuẩn còn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày) [13, 17]. Nhược điểm của xét nghiệm này là yếu tố ngoại nhiễm cao, tuy vậy có thể tránh bằng cách sử dụng đầu côn lọc và dùng enzyme uracil- N- glycosylase trong phản ứng.