I. quy đỊnh chung phạm VI điều chỉnh

Phụ lục 5

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI SUCROGLYCERID

1. Tên khác, chỉ số

2. Định nghĩa

3. Cảm quan

4. Chức năng

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Acid béo

Đường

5.2. Độ tinh khiết

Tro sulfat

Thử 2 g mẫu (Phương pháp I)

Chỉ số acid

Sucrose tự do

Cyclohexan và isobutanol

Chì

5.3. Hàm lượng

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Acid béo

Đường

6.2. Độ tinh khiết

Sucrose tự do

- Dung dịch nội chuẩn: Dung dịch cholesterol trong chloroform 5 mg/ml hoặc tetracosan trong chloroform 10 mg/ml

- Pyridin (làm khô được qua rây phân tử)

- N, O- Bis-(trimethylsilyl)-acetamid (BSA)

- Trimethylchlorosilan (TMCS)

Cách tiến hành: Cân chính xác 20 – 50 mg mẫu cho vào bình silyl hóa, thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn, 1 ml pyridin, 0,5 ml N, O-bis (trimethylsilyl) acetamid (BSA) và 0,5 ml trimethylchlorosilan (TMCS). Đậy nắp bình và gia nhiệt ở 70⁰C trong 30 phút. Bơm 1l vào thiết bị sắc ký khí lỏng.

Các điều kiện sắc ký:

Cột:

- Đường kính trong 4 mm

- Chất liệu: thuỷ tinh

- Được nhồi bằng dexil

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 40 ml/phút

Detector: FID

Chương trình nhiệt độ: giữ ở 160⁰C trong 1 phút sau đó tăng đến 160 – 375⁰C với tốc độ 15⁰C/phút.

Đo các diện tích pic của sucrose và nội chuẩn. Hệ số đáp ứng (RF) được tính từ quá trình chạy sắc ký khí lỏng với các

dung dịch chuẩn sucrose chứa nội chuẩn.

Kết quả:

mg nội chuẩn x diện tích pic sucrose

RF = -----------------------------------------------------

Diện tích pic nội chuẩn x mg sucrose

và

mg nội chuẩn x diện tích pic sucrose x 100

RF x diện tích nội chuẩn x mg mẫu

Dimethylformamid

- Dimethyl formamid

- Dimethylamin hydrochlorid

- Methanol

- Ethanol

- HCl

Chuẩn bị dung dịch gốc dimethylaminhydroclorid trong ethanol 4,47 mg/ml (tương đương với 4,0 mg/ml dimethyl formamid) và chuẩn bị một loạt các dung dịch chuẩn tương ứng với 4; 2 và 1 g/ml dimethylformamid bằng cách pha loãng dung dịch gốc với dung dịch NaOH 0,1% trong ethanol.

Bộ dụng cụ thuỷ phân được trình bày trong phần Phụ lục. Cân chính xác 40 g mẫu cho vào bình đáy tròn dung tích 1.000 ml. Thêm 500 ml dung dịch NaOH 5% trong methanol, và gắn bình vào bộ dụng cụ thuỷ phân. Đặt bình cất bình tam giác chứa 10 ml dung dịch HCl 1% trong methanol vào bộ dụng cụ thuỷ phân. Gia nhiệt bình đáy tròn và chưng cất với sinh hàn ngược có nước làm mát trong 1 giờ, sau đó cất lấy 50 ml dịch cất được thì dừng lại. Cô dịch cất được cho đến khô trong cách thủy sôi. Hoà tan phần cặn bằng một lượng nhỏ ethanol, thêm 2,5 ml dung dịch NaOH 5% trong ethanol và pha loãng đến thể tích 25 ml bằng ethanol để chuẩn bị một dung dịch mẫu.

Bơm 2 l dung dịch mẫu vào thiết bị sắc ký khí lỏng với các điều kiện dưới đây.

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm 2 l các dung dịch chuẩn vào thiết bị sắc ký khí.

Cột:

- Đường kính trong: 2 mm

- Chất liệu: thuỷ tinh

- Cột nhồi: 10% amin 220 và KOH 10% trên nền chromosorb W yếu 80/100 đã được rửa acid yếu

- Luyện cột: Gia nhiệt tới 130⁰C qua đêm với tốc độ dòng nitrogen 5 ml/phút

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 17 ml/phút

Detector: FID

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 198 ±5⁰C

- Cột: 60⁰C.

Tính kết quả:

Nồng độ dimethylformamid (C_DFA) tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ dimethylformamid phát hiện được (g/ml)

W: Khối lượng mẫu (g)

Hoá chất, thuốc thử:

- Dimethylformamid (tinh khiết dùng cho GLC)

- Cyclohexan (dùng cho quang phổ UV)

- Isobutanol (dùng cho phân tích)

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc cyclohexan và isobutanol trong dimethylformamid bằng cách dùng pipet lấy 130 l cyclohexan và 125 l isobutanol cho vào dimethylformamid và làm đầy đến thể tích 10 ml.

Từ dung dịch gốc trên pha một loạt các dung dịch chuẩn pha loãng có 5, 10 và 20 mg/kg cyclohexan và isobutanol. Vẽ đường đáp ứng bằng cách bơm 5 l các dung dịch chuẩn đã pha loãng vào thiết bị sắc ký khí với các điều kiện sau.

Chuẩn bị mẫu thử:

Cân 5 g mẫu chính xác đến 10 mg cho vào bình có nắp đậy thuỷ tinh, thêm vào 5 g dimethylformamid và làm ấm để hoà tan. Làm nguội và bơm 5 l vào thiết bị sắc ký khí với các điều kiện sau.

Cột:

- Dài: 3m

- Chất liệu: thép không rỉ

- Chất nhồi: 20% carbowax 20 M trên Chromosorb G 60/80

Khí mang: heli (áp suất 1,6 bar)

Detector: ion hoá ngọn lửa

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 130⁰C

- Cột: 130⁰C

- Detector: 200⁰C

Xác định nồng độ cyclohexan và isobutanol trong dung dịch mẫu (50%) bằng cách so sánh với các dung dịch chuẩn và nhân nồng độ với 2 để chuyển các kết quả cho phù hợp với sucroglycerid gốc.

- Isopropanol

- Ethyl acetat

Dung dịch chuẩn:

Lấy 1 g mỗi loại isopropanol và ethyl acetat vào một bình định mức và thêm nước cho đến khi đạt thể tích 100 ml, và pha loãng dung dịch này để được các dung dịch có nồng độ 0,02 – 0,4 g/100 ml.

Nếu cần, chuẩn bị các dung dịch chuẩn chứa tới 7 g/100 ml isopropanol và ethyl acetat.

Cách tiến hành:

Cân 1 g chính xác đến 0,1 g bột mẫu cho vào lọ mẫu. Thêm 5 l nước vào lọ mẫu và nắp kín nhanh bằng septum. Để lọ mẫu vào thiết bị sắc ký khí đã đặt trước chương trình và bắt đầu phân tích theo các điều kiện đề cập dưới đây.

Lấy 1 g bột ester của sucrose với các acid béo, không chứa dung môi hoặc các dung môi tồn dư đã biết, cho vào lọ mẫu, thêm 5 l dung dịch chuẩn và đậy kín bằng septum. Để lọ mẫu vào thiết bị sắc ký khí đã đặt trước chương trình và bắt đầu phân tích theo các điều kiện đề cập dưới đây và vẽ được đường chuẩn của mỗi dung môi.

Cột:

- Dài: 30 m

- Chất liệu: mao quản silica

- Fim mỏng: 100% methyl polysiloxan

- Luyện cột: Gia nhiệt tới 60⁰C trong 2 – 3 giờ với tốc độ khí nitrogen khoảng 10 ml/phút.

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 5 ml/phút

Detector: ion hoá ngọn lửa

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 110⁰C

- Cột: 40⁰C.

- Detector: 110⁰C

Buồng không gian hơi:

- Lượng mẫu: 1 g ± 0,1 g + 5 l

- Nhiệt độ gia nhiệt mẫu: 80⁰C

- Thời gian gia nhiệt mẫu: 40 phút

- Nhiệt độ syringe: 85⁰C

- Thể tích mẫu dạng hơi: 0,4 ml

Kết quả: được tính theo công thức:

Trong đó:

C_i: Nồng độ dung môi i (mg/kg);

A_i: Diện tích pic dung môi i (v.giây.);

Cf_i: Hệ số chuyển đổi dung môi i (độ dốc của đường chuẩn) (g/v.giây).

Chì

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.2. Định lượng

Cân chính xác 250 mg mẫu cho vào bình định mức 50 ml. Pha tới thể tích 50 ml bằng tetrahydrofuran và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,5 m.

Bơm 100 l mẫu vào thiết bị sắc ký lỏng cao áp đã ổn định trước.

Các điều kiện sắc ký:

Cột: Styren-divinylbenzen copolymer đối với sắc ký thẩm thấu qua gel (TSK-GEL G2000 (Supelco) hoặc tương đương)

Pha động: tetrahydrofuran dùng cho HPLC đã đuổi khí

Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

Detector: RI (chỉ số khúc xạ)

Nhiệt độ:

- Cột: 38⁰C.

- Detector: 38⁰C

Ghi sắc ký đồ trong khoảng 90 phút.

Tính % ester sucrose trong mẫu:

% ester sucrose = 100 A/T

Trong đó:

A: Tổng các diện tích pic đối với 3 thành phần chính, mono-, di- và tri-ester, rửa giải lần lượt ở khoảng 65, 68 và 73 phút.

T: Tổng diện tích tất cả các pic rửa giải trong khoảng 90 phút

Bộ dụng cụ thuỷ phân:

a: Sinh hàn ngược

b: SInh hàn

c: Bình đáy tròn

d: Chậu nước

e: Bình tam giác