I. quy đỊnh chung phạm VI điều chỉnh

Thêm 2 đến 5 ml heptan (chú ý 4) (lượng chính xác không ảnh hưởng đến phản ứng) qua đầu trên của sinh hàn vào hỗn hợp đang sôi và tiếp tục đun sôi trong 1 phút.

Ngắt nguồn nhiệt, lấy sinh hàn ra. Thêm lượng nhỏ dung dịch natri clorid bão hòa và lắc nhẹ bình bằng cách quay tròn bình vài lần.

Thêm dung dịch natri clorid bão hòa vào bình cầu sao cho mức chất lỏng ngang cổ bình. Để yên cho hỗn hợp tách lớp và chuyển khoảng 1 ml lớp trên (lớp heptan) vào ống nghiệm cổ nhám và thêm vào một lượng nhỏ natri sulfat khan để loại hết nước. Nếu lượng mẫu lấy là 350 mg, dung dịch này chứa khoảng 7-17% methyl ester và có thể bơm trực tiếp vào cột sắc kí khí-lỏng. Nếu không thì pha loãng dung dịch bằng heptan để đạt được nồng độ methyl ester là 5-10% (chú ý 5).

Để thu hồi toàn bộ lượng ester khô, chuyển dung dịch muối và lớp heptan vào phễu tách. Tách riêng các lớp. Chiết phần dung dịch muối 2 lần bằng 50 ml dầu nhẹ. Gộp dịch chiết dầu nhẹ thu được vào phần dung dịch heptan, rửa bằng 20 ml nước đến khi hết acid (thử bằng chỉ thị đỏ methyl). Làm khô bằng natri sulfat khan, lọc và cho bay hơi dung môi trong bể cách thủy và thổi khí nitrogen (chú ý 6 và 7). Với các mẫu có khối lượng nhỏ hơn 500 mg phải giảm thể tích dung môi và nước sử dụng theo tỷ lệ tương ứng.

Bên cạnh phương pháp trên còn có một số phương pháp khác không sử dụng đến bo trifluorid. Nhìn chung có thể thay các thuốc thử methyl hóa, dung dịch natri hydroxyd 0,5N trong methanol và dung dịch bo trifluorid 12-25 %, trong methanol bằng các chất sau:

- Kali hydroxyd 1 N trong methanol, (phản ứng với chất béo khi có mặt lượng dư methanol có hàm lượng nước nhỏ);

- Dung dịch natri methylat (điều chế bằng cách hòa tan 1 g natri kim loại trong 100 ml methanol có hàm lượng nước nhỏ).

7. Một phần các methyl ester dễ bay hơi nhất có thể bị mất nếu thời gian bay hơi dung môi kéo dài, hoặc nếu dòng khí nitrogen quá mạnh,

Thiết bị thông thường dùng cho sắc kí khí lỏng, dùng cột nhồi và detector ion hóa ngọn lửa (chú ý 1). Bất kỳ một thiết bị nào cho hiệu quả và độ phân giải cao với chất béo cần xác định đều phù hợp.

Hệ thống bơm mẫu: Hệ thống bơm mẫu phải có không gian chết nhỏ nhất có thể. Nếu được, phải nâng được nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cột từ 20 đến 50C.

Lò: Lò phải cung cấp cho cột nhiệt độ ít nhất là 220^o và phải duy trì được nhiệt độ cần thiết trong khoảng  1C.

Nếu dùng chương trình đặt nhiệt độ, nên dùng thiết bị có cột đôi.

Cột nhồi:

- Cột: Cột phải được làm từ lọai vật liệu trơ với chất cần phân tích: thủy tinh hoặc nếu không thì dùng thép không rỉ (chú ý 2). Chiều dài: 1 đến 3 m, nên dùng cột tương đối ngắn nếu có các acid mach dài (C₂₀₊). Để xác định các acid béo C₄ và C₆, nên dùng cột 2 m; đường kính trong từ 2 đến 4 mm.

- Chất mang: Diatomid rửa acid và đã được silan hóa, hoặc các chất mang trơ phù hợp khác có khoảng biến thiên đường kính hẹp (25m) trong khoảng đường kính cỡ hạt từ 125-200 µm, cỡ hạt trung bình phải tương quan với đường kính trong và chiều dài cột.

- Pha tĩnh: Dạng polyester của một chất lỏng phân cực (ví dụ diethylen glycol polysuccinat, butandiol polysuccinat, ethylen glycol polyadipat ...) hoặc bất kỳ chất lỏng nào khác (ví dụ cyanosilicon ...) thỏa mãn các điều kiện dưới đây. Pha tĩnh phải chiếm 5 đến 20 % khối lượng nhồi. Có thể dùng một pha tĩnh không phân cực, tùy theo từng phép tách cụ thể.

- Luyện cột mới chế tạo: Tách cột ra khỏi detector. Nếu có thể, từ từ nung lò đến 185C và dẫn dòng khí trơ qua cột với tốc độ 20-60 ml/phút trong ít nhất là 16 giờ tại nhiệt độ này, và thêm 2 giờ nữa tại 195C.

Detector: Các vận hành dưới đây tương ứng với detector ion hóa ngọn lửa (chú ý 1)

Syring: Syring, có dung tích tối đa là 10 µl, chia độ đến 0.1 µl.

Nếu sử dụng đường ghi để tính thành phần hỗn hợp phân tích, phải dùng một máy ghi điện tử có độ chính xác cao. Máy ghi phải tương thích với thiết bị đo. Các đặc trưng của máy ghi phải như sau:

- Tốc độ đáp ứng dưới 1,5 giây, tốt nhất là dưới 1 giây (tốc độ đáp ứng là thời gian cần để bút ghi chạy từ 0 đến 90 % theo 100 % tín hiệu)

- Độ rộng của giấy: tối thiểu là 25 cm

- Tốc độ giấy: 25-100 cm/giờ.

Bộ tích phân Integrator hoặc máy tính (tùy chọn)

Có thể tính một cách nhanh và chính xác nếu dùng bộ tích phân điện tử hoặc máy tính. Trong trường hợp này phải tạo được tín hiệu tuyến tính với độ nhạy phù hợp, và phần hiệu chỉnh cho sự lệch đường nền phải thỏa đáng.

- Khí mang: Khí trơ (nitrogen, heli, argon ...) khô, và chứa ít hơn 10 mg/kg oxy.

- Khí phụ trợ: Hydrogen (tinh khiết tối thiểu 99.9%) không có các tạp chất hữu cơ, không khí hoặc oxygen.

- Các chất chuẩn so sánh: Hỗn hợp của các methyl ester, hoặc các methyl ester của một chất dầu đã biết trước thành phần, tốt nhất là tương tự với chất béo cần phân tích.

Xác định các điều kiện vận hành tối ưu: Các giá trị cho trong bảng 1 và 2 cho dưới đây về nguyên tắc có thể cho các kết quả mong muốn:

Bảng 1

Đường kính trong của cột Khí mang cung cấp

3 mm 20-40 ml/ phút

4 mm 40-60 ml/ phút

Bảng 2

5% 175^o

10% 180^o

15% 180^o

20% 185^o

Nếu được, injector phải ở nhiệt độ khoảng 200^oC và detector phải ở nhiệt độ bằng hoặc cao hơn nhiệt độ cột.

Về nguyên tắc dòng khí hydrogen cung cấp cho detector ion hóa ngọn lửa phải có tốc độ bằng một nửa tốc độ khí mang, và tốc độ khí oxygen phải bằng khoảng 5 đến 10 lần tốc độ khí hydrogen.

Xác định hiệu suất và độ phân giải (tùy chọn)

Tiến hành phân tích mẫu chuẩn methyl stearat. Lựa chọn cỡ mẫu, nhiệt độ cột tách và tốc độ khí mang sao cho peak của methyl stearat xuất hiện 15 phút sau peak dung môi và cao khoảng 3/4 tín hiệu toàn thang.

- Phân tích:

Dùng mẫu kiểm tra là 0,1 đến 2 µl dung dịch heptan của methyl esters, pha theo hưóng dẫn trong phần A. Trong trường hợp không có các ester trong dung dịch, chuẩn bị dung dịch có nồng độ khoảng 10% trong heptan và bơm 0,1 đến 1 µl dung dịch này.

Các điều kiện tiến hành được cho dưới đây. Tuy nhiên, có thể làm việc với nhiệt độ cột thấp hơn nếu xác định các acid có mạch carbon dưới C₁₂ hoặc ở nhiệt độ cao hơn nếu xác định các acid béo trên C₂₀.

Đôi khi có thể sử dụng chương trình đặt nhiệt độ cho cả 2 trường hợp trên. Nếu mẫu có chứa các methyl ester của các acid béo dưới C₁₂, phải bơm mẫu ở nhiệt độ 100C (hoặc ở nhiệt độ từ 50 - 60C nếu có acid butyric) và ngay lập tức tăng nhiệt độ với tốc độ tăng nhiệt từ 4 - 8 C/phút cho đến nhiệt độ tối ưu. Trong một số trường hợp có thể gộp cả 2 qui trình lại: sau khi tăng nhiệt, tiếp tục rửa giải tại nhiệt độ không đổi cho đến khi tất cả các hợp phần được rửa giải ra. Nếu thiết bị không vận hành với chương trình nhiệt độ, làm việc tại 2 nhiệt độ cố định trong khoảng từ 100 đến 195C.

Phân tích hỗn hợp chất chuẩn so sánh có thành phần đã biết trong các điều kiện sử dụng để đo mẫu thử. Đo khoảng cách lưu (hoặc thời gian lưu) cho các ester béo tương ứng. Dùng giấy bán logarit, vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarit khoảng cách lưu (hoặc thời gian lưu) vào số nguyên tử carbon của các acid; trong điều kiện đẳng nhiệt đồ thị của các ester mạch thẳng có cùng độ không bão hòa (no) phải là các đường thẳng. gần như song song với nhau.

Nhận dạng các peak của mẫu thử từ các đồ thị này, nếu cần thì dùng phép nội suy. Phải tránh các điều kiện đo làm xuất hiện các “peak bị che phủ (masked peaks)”, có nghĩa là độ phân giải không đủ lớn để tách được 2 hợp phần.

Phân tích định lượng

Xác định thành phần

Trừ các trường hợp đặc biệt, sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích, có nghĩa là giả thiết rằng toàn bộ các hợp phần đều được biểu diễn trên sắc đồ, sao cho tổng diện tích các peak biểu diễn 100 % các hợp phần (tổng rửa giải).

Bằng một qui trình chuẩn hóa phù hợp (dùng hỗn hợp chuẩn so sánh hoặc dùng chất chuẩn nội), xác định tổng khối lượng của các acid béo trong mẫu khô. Tính hàm lượng muối của các acid béo với các cation đặc trưng trong mẫu. Tổng hàm lượng Muối Acid Béo không được lớn hơn 95% khối lượng mẫu khô. Ngoài ra, nếu có các chỉ tiêu cho hàm lượng của mỗi acid béo ghi trên nhãn sản phẩm, mẫu phải thỏa mãn được các chỉ tiêu này.