LuËn v¨n th¹c sÜ TrÇn V¨n Kh¸nh


X¸c ®Þnh ®éc lùc cña E. coli theo ph­¬ng ph¸p cña Cater (1984) [64]



tải về 1.1 Mb.
trang3/9
Chuyển đổi dữ liệu18.08.2016
Kích1.1 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

2.2.2.4. X¸c ®Þnh ®éc lùc cña E. coli theo ph­¬ng ph¸p cña Cater (1984) [64]


Mçi chñng vi khuÈn ®­îc tiªm cho 2 chuét, liÒu 0,2 ml dÞch nu«i cÊy 24giê/370C vµo phóc xoang. Theo dâi sè chuét chÕt vµ thêi gian giÕt chÕt chuét cña vi khuÈn trong 7 ngµy. Chuét chÕt ®­îc mæ kiÓm tra bÖnh tÝch vµ lÊy m¸u tim, phñ t¹ng nu«i cÊy ph©n lËp vi khuÈn.

2.2.2.5. X¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña E. coli b»ng ph¶n øng g©y dung huyÕt trªn th¹ch m¸u bª 10%


Gièng E. coli thuÇn khiÕt ®­îc ria cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u bª 10%, båi d­ìng ë tñ Êm 370C trong 24 giê.

§¸nh gi¸ kÕt qu¶:

  • Dung huyÕt hoµn toµn (-haemolysin): xung quanh khuÈn l¹c cã vßng tan m¸u to, râ, cã thÓ nh×n qua ®­îc m«i tr­êng.

  • Dung huyÕt kh«ng hoµn toµn (-haemolysin): xung quanh khuÈn l¹c cã vßng tan m¸u nhá, cã ¸nh xanh.

  • Kh«ng dung huyÕt (-haemolysin): xung quanh khuÈn l¹c kh«ng cã vßng tan m¸u.

2.2.2.6. X¸c ®Þnh c¸c gen ®éc tè (LT, STa, STb vµ VT2e) b»ng ph­¬ng ph¸p PCR


HiÖn nay ng­êi ta dïng ph­¬ng ph¸p PCR ®Ó x¸c ®Þnh c¸c gen ®éc tè cña E. coli, ®©y lµ ph­¬ng ph¸p ­u viÖt nhÊt vÒ ®é nh¹y vµ tÝnh chÝnh x¸c cña nã.

- C¸ch tiÕn hµnh:

  • ADN mÉu: khuÈn l¹c E. coli mäc trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u ë 370C/24h.

  • Hçn hîp ph¶n øng PCR:

Primers: 1 l mçi lo¹i

Dung dÞch ®Öm (5 X): 5,0 l

Enzym (Taq polymerase): 0,5 l

N­íc khö ion võa ®ñ ®Ó ®¹t ®­îc thÓ tÝch cuèi cïng lµ 25l cho 1 ph¶n øng.



  • Chu tr×nh cña mét ph¶n øng PCR (Amplification): ph¶n øng PCR lµ mét chuçi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau. Mçi chu kú gåm 3 b­íc vµ ®­îc thùc hiÖn trong m¸y nh©n gen tù ®éng Perkin Elmer, theo b¶ng 1.

  • Ch¹y ®iÖn di: s¶n phÈm PCR thu ®­îc sau chu tr×nh ph¶n øng ®­îc nhuém víi chÊt nhuém nhá mÉu (loading dye), ®­îc trén vµo mÉu theo tû lÖ 1: 5. Sau khi nhuém, s¶n phÈm PCR ®­îc ch¹y ®iÖn di trªn th¹ch agarose 1%, trong dung dÞch ®Öm TAE (Tris - agartate - EDTA) víi hiÖu ®iÖn thÕ 100V trong vßng 40 phót.

  • Nhuém: gel th¹ch sau khi ch¹y ®iÖn di ®­îc nhuém mµu b»ng chÊt nhuém mµu huúnh quang Ethidium bromide (1l/ml) trong vßng 15 phót ®äc kÕt qu¶.

B¶ng 1: Chu tr×nh cña ph¶n øng PCR

Thµnh phÇn

Chu tr×nh thø nhÊt

30 chu tr×nh tiÕp theo

Chu tr×nh cuèi

BiÕn tÝnh (0C/phót)

BiÕn tÝnh (0C/phót)

G¾n måi (0C/phót)

Tæng hîp (0C/phót)

Tæng hîp (0C/phót)

ADN khu«n, primer, Taq polymerase, dNTP

94/5

94/0,5

55/0,5

72/0,5

72/7

- §äc kÕt qu¶:

§äc kÕt qu¶ b»ng c¸ch quan s¸t d­íi ¸nh ®Ìn UV (300nm) vµ chôp ¶nh b»ng hÖ thèng Polaroid camera. Trªn ¶nh chôp nÒn ®en, c¸c ®o¹n axit nucleic hiÖn lªn ë d¹ng b¨ng mµu tr¾ng vµ cã thÓ chôp ¶nh ®­îc vµ ghi nhËn l¹i. KÝch th­íc c¸c b¨ng ADN ®­îc so s¸nh víi ADN chuÈn (ADN marker).



2.2.3. Ph­¬ng ph¸p chÕ t¹o kh¸ng nguyªn

Dïng c¸c chñng E. coli ®· lùa chän nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng dinh d­ìng riªng tõng chñng ë 37oC/24 giê, kiÓm tra ®Ëm ®é vi khuÈn, kiÓm tra thuÇn khiÕt, bÊt ho¹t b»ng nhiÖt ®é hoÆc hãa chÊt, kiÓm tra v« trïng, chia lä ®Ó sö dông.


2.2.4. Nghiªn cøu qui tr×nh miÔn dÞch ®Ó ®¹t hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh gµ cao nhÊt

Chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm tiªm miÔn dÞch cho 3 ®µn gµ thÝ nghiÖm, mçi ®µn theo mét qui tr×nh kh¸c nhau, sau ®ã ®Þnh kú hµng tuÇn kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u gµ ®Ó t×m ra qui tr×nh hîp lý, cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u gµ cao nhÊt, æn ®Þnh nhÊt.



2.2.5. Ph­¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh hµm l­îng kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng kh¶ n¨ng b¶o hé cña kh¸ng thÓ chèng l¹i E. coli trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm

Dïng chuét b¹ch thÓ träng mçi con 18 - 20g, khoÎ m¹nh. Chia lµm 2 nhãm:



  • Nhãm 1: Mçi con tiªm 0,4 ml kh¸ng thÓ vµo phóc xoang; sau 24 giê tiªm lÇn hai cïng liÒu.

  • Nhãm 2: Kh«ng tiªm, lµm ®èi chøng.

Sau 48 giê kÓ tõ khi tiªm kh¸ng thÓ lÇn hai, c«ng c­êng ®éc cho c¶ hai nhãm chuét víi liÒu tiªm d­íi da mçi chuét 0,2 ml canh trïng 24 giê cña c¸c chñng E. coli. Theo dâi chuét trong 7 ngµy sau ®¸nh gi¸ kÕt qu¶.

TÝnh hiÖu sè cña sè l­îng chuét sèng sãt cña nhãm 1 (nhãm ®­îc tiªm miÔn dÞch b»ng kh¸ng thÓ) vµ sè l­îng chuét sèng sãt cña nhãm 2 (nhãm ®èi chøng).



2.2.6. Ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng hµm l­îng kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt gi÷a kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm víi kh¸ng nguyªn E. coli t­¬ng øng

Cã thÓ thùc hiÖn ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh hay ng­ng kÕt chËm trong èng nghiÖm theo th­êng qui.

Pha lo·ng kh¸ng thÓ b»ng n­íc muèi sinh lý theo c¸c ®é pha lo·ng kh¸c nhau (theo cÊp sè 2).

LÊy mét l­îng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét l­îng kh¸ng nguyªn E. coli b»ng nhau, trén ®Òu, ®Ó ë nhiÖt ®é kho¶ng 250C. NÕu lµ ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh th× ®äc kÕt qu¶ sau 3-5 phót, nÕu lµ ng­ng kÕt chËm trong èng nghiÖm th× ®äc kÕt qu¶ sau 6-12 giê b»ng m¾t th­êng.

§èi chøng ©m lµm t­¬ng tù b­íc trªn nh­ng thay thÕ kh¸ng thÓ b»ng n­íc sinh lý. §èi chøng d­¬ng lµm t­¬ng tù b­íc trªn nh­ng thay thÕ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng kh¸ng thÓ E. coli ®· biÕt.

2.2.7. Ph­¬ng ph¸p chÕ t¹o kh¸ng thÓ

Thu ho¹ch trøng, t¸ch lßng ®á, cho vµo lµm ®ång nhÊt b»ng m¸y, bæ sung dung m«i vµ chÊt b¶o qu¶n, ra chai, b¶o qu¶n.




Ch­¬ng 3: KÕt qu¶ vµ bµn luËn
3.1. Ph©n lËp E. coli, chän E. coli cã ®éc lùc, cã tÝnh kh¸ng nguyªn

3.1.1. Thu thËp mÉu bÖnh phÈm lîn èm tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu

C¸c mÉu ®­îc thu thËp ë 8 huyÖn cña 5 tØnh ®¹i diÖn cho 3 miÒn B¾c - Trung - Nam, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thu thËp ®­îc tæng sè 340 mÉu bÖnh phÈm ë lîn èm cã triÖu chøng m¾c bÖnh s­ng phï ®Çu vµ tiªu ch¶y do E. coli g©y nªn. C¸c lo¹i mÉu bÖnh phÈm chóng t«i thu thËp lµ: ph©n, lîn nguyªn con, tim, gan, ruét vµ h¹ch ruét cña lîn bÖnh. KÕt qu¶ cô thÓ trong b¶ng 2.



B¶ng 2: KÕt qu¶ thu thËp mÉu bÖnh phÈm lîn èm tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu

§Þa ®iÓm

Sè c¬ së lÊy mÉu

Lîn nguyªn con

Ph©n

Tim

Gan

Ruét, h¹ch ruét

Tæng sè mÉu

MiÒn Nam

40

5

15

20

18

22

80

MiÒn Trung

40

14

20

21

22

23

100

MiÒn B¾c

80

30

35

37

30

28

160

Tæng céng

160

49

70

78

70

73

340

3.1.2. Nu«i cÊy ®Æc hiÖu cho E. coli, sµng läc vi khuÈn t¹p

Tõ 340 mÉu bÖnh phÈm thu thËp ®­îc ë c¸c vïng, miÒn trªn c¶ n­íc, b­íc ®Çu chän läc E. coli, chóng t«i dïng m«i tr­êng ®Æc hiÖu cho E. coli lµ m«i tr­êng Mac Conkey. KÕt hîp víi c¸c m«i tr­êng kh¸c nh­ lµ m«i tr­êng th¹ch m¸u, m«i tr­êng n­íc thÞt, m«i tr­êng th¹ch th­êng, m«i tr­êng yÕm khÝ ®Ó chän ra nh÷ng chñng cã ®Æc ®iÓm gièng víi E. coli, lo¹i ®­îc nh÷ng vi khuÈn t¹p (kh«ng ph¶i lµ E. coli). KÕt qu¶ cô thÓ ®­îc thèng kª ë b¶ng 3.

Qua b¶ng 3 thÊy r»ng: tõ 340 mÉu bÖnh phÈm ë lîn cã dÊu hiÖu m¾c bÖnh s­ng phï ®Çu vµ Øa ch¶y do E. coli g©y nªn, trªn m«i tr­êng Mac Conkey ph©n lËp ®­îc 266 mÉu vi khuÈn cã ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c gièng víi h×nh th¸i khuÈn l¹c E. coli (mµu hång c¸nh sen), chiÕm tíi 78,24%. Trong ®ã cao nhÊt lµ ë §ång Nai cã tû lÖ 85% vµ thÊp nhÊt lµ NghÖ An cã tû lÖ 68,0% mÉu vi khuÈn cã ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c gièng víi E. coli.

B¶ng 3: KÕt qu¶ ph©n lËp E. coli tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm


STT

§Þa ®iÓm lÊy mÉu

Sè l­îng mÉu

Sè l­îng mÉu cã E. coli

Tû lÖ %

1

§ång Nai

80

68

85,0

2

B×nh §Þnh

50

37

74,0

3

NghÖ An

50

34

68,0

4

H­ng Yªn

80

65

81,25

5

Hµ T©y

80

62

77,5

Tæng

340

266

78,24

KiÓm tra h×nh th¸i vi khuÈn trªn tiªu b¶n khi nhuém Gram: vi khuÈn cã d¹ng trùc khuÈn, hai ®Çu trßn, b¾t mµu Gram ©m, ®øng riªng rÏ. Tõ 266 mÉu vi khuÈn thu ®­îc ë trªn, chóng t«i chän ra ®­îc 135 mÉu vi khuÈn ®Ó lµm c¸c c«ng viÖc tiÕp theo trong qu¸ tr×nh chän läc gièng E. coli.

Do tÝnh chÊt rÊt hay thay ®æi cña E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh ®«ng kh« ngay c¸c chñng ®· ph©n lËp ®­îc ®Ó ®¶m b¶o tÝnh nguyªn vÑn cña vi khuÈn, tr¸nh nh÷ng biÕn ®æi trong qu¸ tr×nh cÊy chuyÓn g©y nªn.



3.1.3. TiÕn hµnh c¸c ph¶n øng sinh vËt hãa häc cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc

3.1.3.1. KÕt qu¶ kiÓm tra ®Æc tÝnh lªn men c¸c lo¹i ®­êng vµ kh¶ n¨ng sinh h¬i

Sau khi s¬ bé ph©n lËp ®­îc 135 chñng vi khuÈn tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm. Chóng t«i x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh lªn men c¸c lo¹i ®­êng: sorbitol, arabinose, galactose, maltose, salicin, lactose, mannit, glucose, fructose, raffinose, saccharose, mannose. §ång thêi còng x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng sinh h¬i cña 135 chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc. KÕt qu¶ cô thÓ nh­ sau:


B¶ng 4: Kh¶ n¨ng lªn men c¸c lo¹i ®­êng cña 135 chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc

Sè mÉu

N=135

Sor

Ara

Gal

Mal

Sal

Lac

Mat

Glu

Fru

Raf

Sac

Man

Gas

KÕt qu¶

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

+

Sè mÉu

101

135

135

135

135

135

135

135

135

120

135

135

135

*Sor: Sorbitol Ara: Arabinose Gal: Galactose Mal: Maltose

Sal: Salicin Lac: Lactose Mat: Mannit Glu: Glucose

Fru: Fructose Raf: Raffinose Sac: Saccharose Man: Mannose

Gas: Ph¶n øng sinh h¬i

(+): Ph¶n øng d­¬ng tÝnh (-): Ph¶n øng ©m tÝnh

§Æc ®iÓm sinh ho¸ cña E. coli lµ cã kh¶ n¨ng lªn men c¸c lo¹i ®­êng glucose, ®­êng lactose vµ mét sè ®­êng kh¸c, nh­ng kh«ng cã kh¶ n¨ng lªn men ®­êng saccharose còng nh­ ®­êng salicin. Qua b¶ng 4, ta thÊy tÊt c¶ c¸c chñng ph©n lËp ®­îc ®Òu cã ®Çy ®ñ c¸c tÝnh chÊt sinh ho¸ ®Æc tr­ng cña E. coli, do ®ã c¸c chñng nµy tiÕp tôc ®­îc x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u.



3.1.3.2. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh dung huyÕt cña c¸c chñng

Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña c¸c chñng theo ph­¬ng ph¸p sau: c¸c chñng E. coli ®­îc ria cÊy trªn m«i tr­êng Blood Agar Base cã bæ sung 10% m¸u bª, nu«i cÊy ë ®iÒu kiÖn 37­­oC/18 - 24giê, ®äc kÕt qu¶. Kh¶ n¨ng g©y dung huyÕt ®­îc ®¸nh gi¸ theo 3 kiÓu lµ -haemolysin (ký hiÖu: ) ; -haemolysin (ký hiÖu: ) vµ ©m tÝnh (ký hiÖu: ­-). KÕt qu¶ cô thÓ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 5.



B¶ng 5 cho thÊy, trong 135 chñng E. coli ®· ®­îc chän läc ë trªn chØ cã 50 chñng cã kh¶ n¨ng dung huyÕt chiÕm 37%, cßn l¹i 85 chñng kh«ng cã kh¶ n¨ng dung huyÕt (chiÕm 63%). Theo c¸c tµi liÖu nghiªn cøu tr­íc ®©y, c¸c chñng cã kh¶ n¨ng dung huyÕt lµ c¸c chñng cã ®éc tÝnh, cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh trªn lîn cao h¬n so víi c¸c chñng kh«ng dung huyÕt (theo tµi liÖu nghiªn cøu cña: Cï H÷u Phó, NguyÔn Ngäc Nhiªn, Vò B×nh Minh vµ §ç Ngäc Thuý vÒ kÕt qu¶ ph©n lËp E. coliSalmonella ë lîn m¾c bÖnh tiªu ch¶y, x¸c ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt ho¸ häc cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc vµ biÖn ph¸p phßng trÞ). V× vËy chóng t«i ®· chän 50 chñng dung huyÕt trªn ®Ó thùc hiÖn c¸c b­íc tiÕp theo trong qu¸ tr×nh chän läc E. coli

B¶ng 5: §Æc tÝnh dung huyÕt cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®­îc

STT

§Þa ph­¬ng lÊy mÉu

Sè mÉu kiÓm tra

Sè mÉu dung huyÕt

Tæng sè mÉu dung huyÕt

Tû lÖ dung huyÕt (%)

D¹ng 

D¹ng 

1

§ång Nai

30

6

8

14

47

2

B×nh §Þnh

25

4

5

9

36

3

NghÖ An

28

5

4

9

32

4

H­ng Yªn

27

4

6

10

37

5

Hµ T©y

25

3

5

8

32

Tæng

135

22

28

50

37





H×nh 1: H×nh ¶nh dung huyÕt cña E. coli

3.1.3.3. KiÓm tra ®Æc tÝnh di ®éng

Sau khi x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña c¸c chñng, chóng t«i cÊy 50 chñng nµy vµo m«i tr­êng th¹ch b¸n láng trong èng nghiÖm ch÷ U (cÊy ë mét ®Çu èng nghiÖm) nu«i ë ®iÒu kiÖn 37­­oC, cø sau 6 tiÕng ®äc kÕt qu¶ 1 lÇn. KÕt qu¶ ®­îc ®¸nh gi¸ dùa vµo kh¶ n¨ng ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong m«i tr­êng (cã thÓ thÊy râ b»ng m¾t th­êng). MÉu d­¬ng tÝnh lµ mÉu mµ vi khuÈn cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ra m«i tr­êng xung quanh vµ ph¸t triÓn sang nh¸nh bªn cña èng nghiÖm ch÷ U. Cßn mÉu ©m tÝnh lµ mÉu mµ vi khuÈn kh«ng cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ra m«i tr­êng xung quanh, chóng chØ cã thÓ ph¸t triÓn t¹i vÞ trÝ cÊy gièng, sau ®©y lµ kÕt qu¶ cô thÓ.



B¶ng 6: Kh¶ n¨ng di ®éng cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®­îc

STT

§Þa ®iÓm lÊy mÉu

Sè mÉu

kiÓm tra

Sè mÉu

di ®éng

Sè mÉu kh«ng di ®éng

1

§ång Nai

14

9

5

2

B×nh §Þnh

9

5

4

3

NghÖ An

9

6

3

4

H­ng Yªn

10

7

3

5

Hµ T©y

8

5

3

Tæng

50

32

18






H×nh 2: TÝnh di ®éng cña E. coli



Sau khi tiÕn hµnh x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng di ®éng cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®­îc, bé s­u tËp E. coli ph©n lËp ®­îc ®­îc chia thµnh 2 nhãm:

+ Nhãm cã kh¶ n¨ng di ®éng cã 32 chñng.

+ Nhãm kh«ng cã kh¶ n¨ng di ®éng cã 18 chñng.

3.1.4. §Þnh typ huyÕt thanh cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc

C¸c chñng E. coli ®­îc gi÷ b»ng ®«ng kh«, chóng ®­îc hoµn nguyªn vµ nu«i cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u, sau ®ã dïng kh¸ng huyÕt thanh chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt huyÕt thanh häc ®Ó x¸c ®Þnh c¸c chñng cã mang kh¸ng nguyªn quan träng lµ c¸c kh¸ng nguyªn pili nh­ K88, K99, K987p,.... KÕt qu¶ chi tiÕt ®­îc thèng kª ë b¶ng 7.



B¶ng 7: KÕt qu¶ ®Þnh typ huyÕt thanh cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp

§Þa ®iÓm

Sè l­îng

K99 (F5)

K88 (F4)

987P (F6)

K30

K98

O141 K85ab

O149 K91

O8 K87

+

+

+

+

+

+

+

+

§ång Nai

14

1

1




1

2

1

1




B×nh §Þnh

9







1

1

1

1

1




NghÖ An

9




1

1




1







1

H­ng Yªn

10

1




1

1




3




1

Hµ T©y

8

1




1







2




1

Tæng

50

3

2

5

3

4

7

2

3



1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương