Nghiªn cøu m«i tr­êng vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy thÝch hîp ®Ó s¶n sinh ®éc tè E. coli

Song song víi nghiªn cøu ®éng th¸i sinh tr­ëng cña vi khuÈn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö ®éc lùc cña dÞch nu«i cÊy theo tõng c«ng thøc vµ m«i tr­êng kh¸c nhau b»ng c¸ch tiªm cho chuét b¹ch.

Sau khi nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng cã c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau, dÞch nu«i cÊy sèng ®­îc ly t©m ë 7000g/15 phót, thu phÇn n­íc trong, läc qua mµng läc cã kÝch th­íc lç läc 0,2 μm, dung dÞch thu ®­îc sau khi läc gäi lµ dÞch chøa ®éc tè, ký hiÖu lµ T₂, chóng t«i tiÕn hµnh tiªm dÞch qua läc T₂ cho chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®éc lùc giÕt chuét ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 13.

Qua b¶ng 14 chóng t«i thÊy víi c«ng thøc 5 E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. LÆp l¹i vµ më réng, chóng t«i chÕ t¹o dÞch nu«i cÊy ®éc tè víi tõng chñng E. coli b»ng m«i tr­êng 9 vµ nu«i cÊy theo c«ng thøc 5, sau ®ã kiÓm tra ®éc lùc dÞch nu«i cÊy víi tõng chñng vµ ®a chñng (trén 10 chñng) b»ng c¸ch: tiªm 0,4 ml/con dÞch qua läc T₂ vµo tÜnh m¹ch chuét b¹ch, theo dâi tû lÖ chuét chÕt/tiªm. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 15.

“chuét èm” lµ chuét sau khi tiªm rÊt mÖt, thë m¹nh, thë dèc, l«ng dùng lªn, n»m gôc, kh«ng muèn ho¹t ®éng, tô thµnh tõng ®¸m, bá ¨n. Cã con thØnh tho¶ng bÞ co dËt, cã con ®iªn cuång, ch¹y lung tung, cã con liÖt ch©n sau, ®i kÐo lª trªn sµn. Tr­íc khi chuét chÕt cã thÓ co dËt hoÆc kh«ng; còng cã tr­êng hîp chuét chÕt nhanh, co dËt mÊy lÇn råi chÕt, sau 48 giê con nµo kh«ng chÕt th× håi phôc dÇn.

KÕt qu¶ cho thÊy tõng chñng cã ®éc lùc cña ®éc tè kh¸c nhau, tõng chñng cã thÓ lµm chuét chÕt hoÆc èm kh¸c nhau (chuét ®èi chøng kh«ng cã hiÖn t­îng nµy). Nh­ng ë ®éc tè poly (trén nhiÒu chñng) th× ®éc lùc thÓ hiÖn râ rÖt. §ã lµ sù céng h­ëng cña c¸c ®éc tè.

V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i lµ chÕ t¹o kh¸ng nguyªn cã chøa hçn hîp ®éc tè cña nhiÒu chñng E. coli, ®Ó kh¸ng thÓ thu ®­îc cã thÓ ®èi phã víi tÝnh phøc t¹p cña E. coli vµ tÝnh ®a d¹ng bÖnh cña nã g©y ra còng nh­ dÞch tÔ häc cña c¸c bÖnh nµy trong thùc tÕ ch¨n nu«i.

3.3. Nghiªn cøu ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn

3.3.1. Nghiªn cøu ph­¬ng ph¸p lµm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc

KÕ thõa nh÷ng nghiªn cøu tr­íc ®©y vÒ E. coli vµ ®éc tè E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p sau:

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ë nhiÖt ®é 70⁰C trong 30 phót.

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 3 ⁰/₀₀.

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng phenol 5 ⁰/₀₀.

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng thiomersal 0,4⁰/₀₀.

M«i tr­êng sau khi nu«i cÊy ®¹t tiªu chuÈn ®­îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè, ®­îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p trªn. DÞch nu«i sau khi xö lý, ®­îc ®Æt trong tñ Êm 37⁰C trong 24h.

Sau ®ã chóng t«i tiÕn hµnh kiÓm tra v« trïng theo th­êng quy trªn c¸c m«i tr­êng kh¸c nhau ®Ó xem ë ®iÒu kiÖn ®ã cã bÊt ho¹t ®­îc vi khuÈn hay kh«ng. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 16.

B»ng kÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng chóng t«i nhËn thÊy c¶ 4 ph­¬ng ph¸p v« ho¹t vµ gi¶i ®éc trªn ®Òu cã kh¶ n¨ng bÊt ho¹t E. coli.

TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra hiÖu qu¶ gi¶i ®éc cña c¸c ph­¬ng ph¸p trªn b»ng c¸ch ly t©m dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t, lÊy n­íc trong läc qua mµng 0,2 m thu ®­îc dÞch läc gäi lµ “gi¶i ®éc tè”, sau ®ã tiªm gi¶i ®éc tè ®ã cho chuét b¹ch 18 - 20 gam víi liÒu tiªm 0,4 ml vµo tÜnh m¹ch vµ so s¸nh víi tiªu chuÈn ®éc tè ë trªn (tiªu chuÈn ®Ó ®¸nh gi¸ ®éc tè E. coli ®ã lµ cø 0,4ml ®éc tè khi tiªm tÜnh m¹ch cho chuét 18 – 20g, ph¶i g©y chÕt Ýt nhÊt lµ 40% tæng sè chuét ®­îc tiªm). NÕu gi¶i ®éc tè g©y chÕt tíi 40% sè chuét thÝ nghiÖm th× ®éc tè ®ã ch­a ®­îc gi¶i ®éc, tøc lµ ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc ®ã kh«ng ®¹t vµ ng­îc l¹i. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 17.

B¶ng 17: TÝnh an toµn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc

• 
  Ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng phenol vµ thiomersal kh«ng nh÷ng kh«ng mang l¹i hiÖu qu¶ gi¶i ®éc mµ cßn lµm t¨ng tÝnh ®éc cña ®éc tè, do ®ã kh«ng thÓ dïng hai hãa chÊt nµy ®Ó gi¶i ®éc ®­îc.
  
• 
  Ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng formol 3⁰/₀₀ vµ 70⁰C/30 phót cã hiÖu qu¶ gi¶i ®éc t­¬ng ®èi tèt.
  

TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 3⁰/₀₀ vµ 70⁰C/30 phót. Chóng t«i dïng dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®ù¬c bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ®Ó tiªm miÔn dÞch cho chuét b¹ch 18 - 20 gam liÒu 0,4 ml/con vµo d­íi da. Sau tiªm 21 ngµy lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh kiÓm tra hiÖu gi¸ ng­ng kÕt. KÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 18.

Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy chuét tiªm dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®­îc xö lý b»ng formol nång ®é 3⁰/₀₀ cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n (trung b×nh 1/128). Nh­ vËy ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 3⁰/₀₀ ë 37^oC trong 24h cã hiÖu qu¶ tèt nhÊt. DÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc, ®éc lùc gi¶m ®i nh­ng vÉn cã tÝnh kh¸ng nguyªn.

§éc tè cña E. coli lµ mét yÕu tè quan träng tham gia vµo qu¸ tr×nh g©y bÖnh tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, sau khi ®· chÕ t¹o ®­îc dÞch nu«i chøa gi¶i ®éc tè nh­ trªn, cÇn x¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè trong dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· gi¶i ®éc.

Chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè trªn ®èi t­îng lµ chuét b¹ch víi ph­¬ng ph¸p nh­ sau:

• 
  ChÕ t¹o gi¶i ®éc tè E. coli (Kh¸ng nguyªn ®éc tè T₂): dÞch nu«i cÊy chøa ®éc tè (hçn hîp 10 chñng E. coli) ®­îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè E. coli ®a gi¸ ®­îc gi¶i ®éc b»ng focmol 3⁰/₀₀ ë 37^oC/24h, ly t©m víi tèc ®é 7000g/15phót, lÊy n­íc trong läc qua mµng läc cã kÝch th­íc lç läc 0,2 μm, thu dÞch läc, dÞch läc ®ã gäi lµ gi¶i ®éc tè _­ E. coli ®a gi¸ (hçn hîp gi¶i ®éc tè 10 chñng E. coli). NÕu chÕ t¹o víi mét chñng E. coli th× gäi lµ gi¶i ®éc tè T2 chñng E. coli ®ã.
  
• 
  ChÕ t¹o kh¸ng huyÕt thanh:
  

HuyÕt thanh ®­îc ly t©m (tèi thiÓu 4500g/phót) lo¹i hÕt cÆn (nÕu cã). HuyÕt thanh ®­îc pha lo·ng theo cÊp sè 2 nh­ th­êng quy, bæ sung kh¸ng nguyªn ®éc tè vµo huyÕt thanh ®· pha lo·ng theo tû lÖ thÓ tÝch 1:1. HiÖu gi¸ ®­îc x¸c ®Þnh lµ ®é pha lo·ng huyÕt thanh cao nhÊt mµ vÉn thÊy kÕt tña. KÕt tña xuÊt hiÖn râ sau 36 – 48 giê vµ kÕt luËn ë 72 giê sau ph¶n øng. KÕt qu¶ cña ph¶n øng ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 18.

Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy, ph¶n øng gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét ®Òu cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh, ngoµi ra cßn x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè, tøc lµ ®· cã sù kÕt hîp gi÷a ®éc tè vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu t­¬ng øng. §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®· g©y ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch.

§Ó ph©n tÝch thªm vÒ ®éc tè E. coli trong hçn hîp ®éc tè, chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng ADP theo kü thuËt Owchterlony. Thµnh phÇn tham gia ph¶n øng gåm cã, kh¸ng nguyªn ®éc tè ®­îc bè trÝ ë giÕng trung t©m, cßn c¸c giÕng xung quanh lµ huyÕt thanh chuét miÔn dÞch ®­îc pha lo·ng theo cÊp sè 2. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 19.

KÕt qu¶ cña c¸c ph¶n øng huyÕt thanh trªn cho thÊy:

• 
  Gi¶i ®éc tè E. coli cã tÝnh kh¸ng nguyªn tèt, ®· kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch.
  
• 
  Kh¸ng ®éc tè trong huyÕt thanh chuét ®­îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè cã thÓ ®­îc ph¸t hiÖn qua ph¶n øng kÕt tña víi kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli trong èng nghiÖm, qua ph¶n øng ADP trong gel th¹ch. Qua hai ph¶n øng ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè.
  
• 
  Mçi chñng E. coli cã kh¶ n¨ng s¶n sinh ®éc tè víi hµm l­îng kh¸c nhau. §éc tè ®a gi¸ m¹nh h¬n vµ g©y miÔn dÞch tèt h¬n ®éc tè ®¬n gi¸.
  

Chóng t«i sö dông c¸c chÊt bæ trî: ISA vµ IMS cña h·ng Septic, Al(OH)₃ vµ alum cña SPI Pharma. Mçi chÊt bæ trî ®­îc bæ sung vµo dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®­îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc (gäi lµ t¾t lµ kh¸ng nguyªn) víi tû lÖ thÝch hîp. Tr­íc tiªn chóng t«i tiÕn hµnh thö an toµn trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ thu ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 20.

Chóng t«i tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc cña hai s¶n phÈm trªn b»ng c¸ch miÔn dÞch liÒu 0,4ml/con theo ®­êng tiªm d­íi da trªn chuét b¹ch vµ so s¸nh víi ®èi chøng (®èi chøng lµ chuét miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). Sau khi tiªm 21 ngµy, tiÕn hµnh lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh, kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh. KÕt qu¶ cô thÓ nh­ sau:

§èi víi chÊt bæ trî lµ Al(OH)­_3­ ë mçi nång ®é kh¸c nhau th× g©y ra ®¸p øng miÔn dÞch kh¸c nhau trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm. Trong ®ã nång ®é 2⁰/₀₀ cho kÕt qu¶ tèt nhÊt thÓ hiÖn qua hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cña huyÕt thanh chuét lµ cao nhÊt (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/204,8). Nång ®é tèi ­u cña chÊt bæ trî alum còng lµ 2⁰/₀₀ (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/230,4).

Tõ nh÷ng kÕt qu¶ trªn, chóng t«i quyÕt ®Þnh chän alum bæ sung víi nång ®é 2 ⁰/₀₀ lµm chÊt bæ trî cho kh¸ng nguyªn vµ sö dông cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo.
3.5. Nghiªn cøu tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn

Sau khi ®· chän ®­îc chÊt bæ trî thÝch hîp lµ alum 2⁰/₀₀ chóng t«i s¶n xuÊt 3 l« liªn tôc ®Ó kh¶o s¸t tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn nµy trªn nhiÒu lo¹i ®éng vËt kh¸c nhau: chuét lang 250 - 300 gam , thá 1800 - 2000 gam vµ b¶n ®éng vËt lµ gµ hËu bÞ. Mçi loµi ®éng vËt cã mét liÒu l­îng kh¸ng nguyªn kh¸c nhau, ®­êng ®­a thuèc vµo lµ tiªm d­íi da, riªng ®èi víi gµ ®­êng ®­a thuèc vµo lµ tiªm b¾p. Sau khi tiªm, chóng t«i tiÕn hµnh theo dâi c¸c ph¶n øng cña ®éng vËt thÝ nghiÖm vµ sè l­îng ®éng vËt bÞ chÕt trªn tæng sè ®éng vËt ®­îc tiªm. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®­îc thèng kª ë b¶ng 22.

3.6. Nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn vµ nghiªn cøu thêi gian s¶n sinh miÔn dÞch sau khi tiªm

§Ó nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm trªn chuét b¹ch 18-20 gam, víi sè l­îng lµ 40 con cho mét lÇn thÝ nghiÖm. Cø mét tuÇn sau khi miÔn dÞch, tiÕn hµnh lÊy m¸u 10 con ®Ó kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u cña c¸c chuét thÝ nghiÖm. ThÝ nghiÖm ®­îc lÆp l¹i 3 lÇn. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cô thÓ nh­ sau:

B¶ng 23: TÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch

B¶ng 23 vµ h×nh 5 cho thÊy sau khi miÔn dÞch mét tuÇn c¸c chuét thÝ nghiÖm ch­a cã sù ®¸p øng miÔn dÞch, sang tuÇn thø hai trong huyÕt thanh chuét ®· b¾t ®Çu cã kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i kh¸ng nguyªn E. coli nh­ng hiÖu gi¸ vÉn cßn thÊp (kho¶ng 1/32). ë tuÇn thø ba thø t­ hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ lµ cao nhÊt (kho¶ng 1/128 – 1/256).