Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN


Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị phân tử



trang6/12
Chuyển đổi dữ liệu19.07.2016
Kích1 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12

1.4. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị phân tử

1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua chỉ thị ADN


Chỉ thị phân tử dựa trên ADN là công cụ hiệu quả vượt xa chỉ thị hóa sinh và hình thái trong việc đánh giá đa dạng di truyền. Lợi thế của các chỉ thị phân tử dựa trên ADN là có thể xác định được những khác biệt nhỏ nhất ở mức ADN, có khả năng tạo ra hàng chục, hàng trăm locus và trên mỗi locus có thể phát hiện được nhiều allele cùng một lúc.

Nhờ có chỉ thị ADN, ngày nay việc đánh giá đa dạng di truyền lúa đã trở nên dễ dàng và hiệu quả hơn nhiều, tuy nhiên các kỹ thuật có liên quan đến chỉ thị ADN đòi hỏi phải đầu tư lớn và tốn kém. Có rất nhiều chỉ thị ADN đang được sử dụng và liên tục được phát triển.


1.4.2. Một số chỉ thị phân tử dựa trên phản ứng PCR


  • Chỉ thị phân tử RAPD ( Random Amplified Plymorphic DNA)

RAPD (đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là một trong những phương pháp nghiên cứu đa hình dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR do William(1990), Wesh và cs. Phát minh. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bội ngẫu nhiên bằng việc dùng một mồi đơn chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên dài 10 nucleotide. Các mồi đơn gắn vào hai điểm khác nhau của hai mạch đơn đối diện của đoạn ADN khuôn. Nếu các điểm gắn mồi nằm trong khoảng cách có thể nhân bội được (thường từ 200 - 2000 nucleotitde) thì đoạn ADN đó được nhân lên. Ưu điểm chính của kỹ thuật này là không cần phải biết trình tự nucleotide ở ADN được nhân bội, kỹ thuật tương đối đơn giản, nhanh và dễ thực hiện [41].

Chỉ thị RAPD thường được dùng để phân tích và xác định quan hệ di truyền giữa các cá thể trong công tác lai tạo hay phân loại. Chúng cũng được sử dụng để xác định các gen kiểm soát hoặc liên quan đến một tính trạng nào đó của cây trồng. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD không ổn định khi tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện khác nhau.

Như vậy RAPD là phương pháp PCR sử dụng mồi ngẫu nhiên cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một trình tự nucleotide nhất định.


  • Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Tác giả Vos và cs (Vos và cs, 1995) lần đầu tiên phát triển kỹ thuật AFLP. ADN genome được cắt thành các phân đoạn có kích thước khác nhau, trong số đó sẽ có các phân đoạn mang các đầu mút giống nhau. Nếu như sử dụng một đoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm một số oligonucleotide được chọn lọc trước để định hướng cho việc gắn của các cặp mồi PCR, thì tất cả những đoạn ADN có đầu mút giống nhau sẽ được nhân bội. Khi thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotide được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn ADN khác nhau [39].

Kỹ thuật này ra đời mang lại nhiều thuận lợi cho phân tích di truyền và lập bản đồ. AFLP kết hợp được sự chính xác của RFLP và sự tiện lợi của PCR vì vậy AFLP đã nhanh chóng trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay.

Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kĩ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lượng ADN tổng số sử dụng cho kĩ thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên, mặt hạn chế của AFLP là chỉ thị di truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và dị hợp, giá thành cho nghiên cứu tương đối cao.


  • Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại trình tự đơn giản)

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6 bp (Litt ADN Luty, 1989; Jacob et al, 1991). Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật. Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại [26].

+ Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.

+ Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác.

+ Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau.

Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.

Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL).

* Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR

Thuận lợi to lớn của phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khá năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền (Hokanson và cs., 1998) [24].

SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn (Schlotterer và cs, 1994). SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Tác giả Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR.

Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những primer SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần (Hokanson và cs., 1998) [24].

Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau.

Hiện nay, đã có khoảng 2.740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157 kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR (Akagi và cs., 1996 [16], Chen và cs., 1997 [20]; Chen và cs., 2002 [19]; Cho và cs., 2000 [22]; Coburn và cs., 2002 [23]; McCouch, 2002 [29]; Paunaud và cs.,1996 [33]).



: phenotype -> upload -> article
article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7)
article -> MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ
article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5)
article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú
article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3
article -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr
article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4
article -> Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng
article -> Xanthomonas oryzea pv oryze, đ
article -> ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa


1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương