ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa

Việt Nam là một trong những trung tâm phát sinh và đa dạng di truyền nguồn gen cây lúa. Với nhiều tập đoàn giống lúa địa phương phong phú, đa đạng và rất nhiều nguồn gen lúa có các đặc tính nông sinh học quí (như: chịu hạn, chịu mặn, kháng rầy nâu, đạo ôn, khô vằn, bạc lá…vv) nhưng chưa được khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả. Để khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa bản địa trong các chương trình chọn và lai tạo giống, đòi hỏi phải có những thông tin về phenotype và genotype. Việc giải mã toàn bộ hệ gen của các giống lúa bản địa sẽ cung cấp thông tin ở mức phân tử một cách đầy đủ nhất. Dựa vào trình tự bộ gen có thể lập bản đồ và xây dựng được hệ thống marker phân tử bao phủ toàn bộ genome; chú giải cấu trúc hệ gen; nghiên cứu chức năng sinh học của gen và chức năng của gen trong việc điều hòa hay tương tác với các gen và các phân tử khác; nghiên cứu biểu hiện của gen; xác định các locus tính trạng số lượng (QTL - Quantitative Trait Loci)..vv.

Để giải mã thành công hệ gen của một loài thực vật nào đó, một công đoạn rất quan trọng là quá trình tách chiết ADN với số lượng lớn, nồng độ cao, tinh sạch và chất lượng cực tốt (ADN không bị đứt gãy) để xây dựng thư viện hệ gen phục vụ cho quá trình giải mã.

II. TỔNG QUAN

2.1. Các phương pháp và chiến lược giải trình tự hệ gen mới

Do yêu cầu cao của việc giải trình tự trong một thời gian ngắn với chi phí thấp đã dẫn đến kĩ thuật giải trình tự hiệu suất cao: bằng cách tạo ra hàng nghìn hay hàng triệu trình tự cùng lúc. Giải trình tự hiệu suất cao được mong đợi làm giảm giá thành giải trình tự ADN so với phương pháp trước kia [13].

Hầu hết các phương pháp giải trình tự đều sử dụng bước nhân dòng trong ống nghiệm để khuếch đại các phân tử ADN, bởi vì các kĩ thuật phát hiện ADN không đủ nhạy cho việc giải trình tự một phân tử riêng lẻ. Trong kĩ thuật PCR nhũ tương (Emulsion PCR): từng phân tử ADN riêng lẻ cùng với hạt mang mồi được bao bọc trong các giọt nước nằm trong pha dầu, phản ứng chuỗi trùng hợp sau đó bao bọc các hạt cùng với các bản sao của phân tử ADN được bất động hóa cho việc giải trình tự tiếp theo. Phản ứng PCR nhũ tương được sử dụng trong phương pháp của Marguilis và cộng sự (được thương mại hóa trong hệ thống máy 454 Life Sciences, Roche). Shendure và cộng sự còn đưa ra phương pháp “giải trình tự xúc xích” (Polony sequencing) và phương pháp giải trình tự rắn (Solid sequencing), (được phát triển bởi Agencourt, nay là Applied Biosystems). Một kĩ thuật khác là PCR cầu: các phân đoạn được khuếch đại dựa vào các mồi được gắn với bề mặt rắn, được sử dụng trong hệ thống phân tích hệ gen Illumina. Kĩ thuật đơn phân tử được phát triển bởi phòng thí nghiệm của Stephen Quake (sau này được thương mại hóa bởi hãng Helicos) là một ngoại lệ: nó sử dụng huỳnh quang phát sáng và sự kích thích tia laze để phát hiện từng sự kiện pyrosequencing ở từng phân tử ADN riêng lẻ đã cố định trên một bề mặt, loại bỏ sự cần thiết phải khuếch đại phân tử ADN [21], [22].

Các phân tử ADN được gắn vào một bề mặt và việc giải trình tự được diễn ra song song (ngang hàng giữa các phân tử ADN). Giải trình tự bằng cách tổng hợp, giống như giải trình tự bằng cách điện di phần kết thúc nhuộm, sử dụng một phân tử ADN polymerase để xác định trình tự cơ sở. Các kĩ thuật phần kết thúc thuận nghịch (được sử dụng trong hệ thống Illumina và Helicos) sử dụng các phiên bản thuận nghịch của phần kết thúc nhuộm, bổ sung một nuleotide vào cùng một thời điểm, cố định huỳnh quang ở mỗi vị trí trong thời gian thực hiện, bằng cách lặp lại việc loại bỏ nhóm bị khóa để cho phép việc kéo dài chuỗi với các nuleotide khác. Pyrosequencing (được sử dụng trong hệ máy 454, Roche) cũng sử dụng sự kéo dài chuỗi ADN, bằng cách bổ sung một loại ADN vào một thời điểm và đồng thời xác định số lượng nucleotide được bổ sung để đưa ra vị trí thông qua phát sáng bằng cách loại bỏ nhóm pyriphosphate gắn kèm [22].

Giải trình tự bằng phản ứng gắn sử dụng một enzyme ADN ligase để xác định trình tự đích, nó được sử dụng trong phương pháp “xúc xích” và trong công nghệ SOLiD của AB. Phương pháp này sử dụng một tập hợp có thể tồn tại các oligonucleotide có chiều dài xác định, được đánh dấu theo vị trí biết trước. Các oligonucleotide được tôi luyện và gắn lại; các ADN có trình tự bổ sung sẽ bắt cặp vào từng vị trí và sẽ được xác định trình tự [37].

Trong phương pháp này, toàn bộ chu trình nhiệt khuếch đại ADN cũng như phân tách chúng bằng điện di được thực hiện trong một bản kích xốp (đường kính xấp xỉ 10 cm) do đó giảm thiểu hóa chất cũng như chi phí. Tuy nhiên phương pháp này vẫn chỉ đang trong giai đoạn thử nghiệm chưa có báo cáo cụ thể về việc thương mại hóa [37].

Từ khi phương pháp giải mã ADN được phát minh giữa thập niên 70 của thế kỷ 20, thiết bị công nghệ cho giải đã trải qua các thế hệ sau:

• 
  Thiết bị giải mã ADN thủ công (1975-1985): dựa trên phương pháp hóa học hoặc kết thúc chuỗi với các thiết bị cần thiết như: điện di tấm/bản gel, đánh dấu phóng xạ, chụp ảnh phóng xạ tự ghi. Quá trình giải mã ADN diễn ra chậm chạp hoàn toàn thủ công và độc hại.
  
• 
  Thiết bị giải mã ADN bán tự động và thiết bị giải mã gen tự động thế hệ I (1986-2000) dựa trên phương pháp kết thúc chuỗi với một số thay đổi, đánh dấu huỳnh quang mồi, đọc qua đầu dò phát hiện bằng tia laze.
  
• 
  Thiết bị giải mã ADN tự động thế hệ I nâng cấp (từ 2000 đến nay): dựa trên phương pháp kết thúc chuỗi nhưng cải tiến đánh dấu huỳnh quang trên các ddNTPs (nhuộm phần kết thúc), điện di mao quản. Các thiết bị thuộc thế hệ I nâng cấp cho phép giải trình tự cùng một lúc vài trăm phân mảnh ADN với kích thước từ 300-900 nucleotide (số lượng và kích thước phân mảnh ADN có thể xác định trình tự phụ thuộc đời máy). Hiện nay, các thiết bị thuộc thế hệ I (đang chiếm số lượng lớn trên thế giới và cả ở Việt Nam) là thiết bị cơ bản cho bất kỳ phòng thí nghiệm liên quan đến nghiên cứu di truyền học và phân tích hệ gen. Tuy nhiên, với các hệ gen có kích thước lớn thì cần có các phòng thí nghiệm trang bị nhiều máy thế hệ I nâng cấp hoặc cần sự kết hợp của nhiều phòng thí nghiệm của quốc gia hoặc quốc tế cho từng dự án lớn bên cạnh yêu cầu về số lượng nhân sự có trình độ để vận hành và phân tích kết quả.
  
• 
  Thiết bị giải mã ADN tự động thế hệ II (từ 2007): dựa trên công nghệ chip ADN, khuếch đại từng phân tử ADN, giải trình tự ngang hàng cùng lúc hàng nghìn hoặc hàng triệu phân tử ADN cho phép nâng hiệu suất giải trình tự lên vài trăm lần thậm chí vài nghìn lần so với thế hệ thứ I nâng cấp [37]. Hiện nay, có nhiều hãng với nhiều công nghệ khác nhau đã thương mại hóa các thiết bị thế hệ II này. Tuy nhiên, giá thành còn rất cao nên mới được các phòng thí nghiệm có quy mô và ngân sách lớn đưa vào sử dụng. Các máy thế hệ thứ II là công cụ quan trọng không thể thiếu với các dự án genome quy mô lớn để phân tích hệ gen của nhiều cá thể.
  
• 
  Thế hệ giải mã ADN tự động thế hệ III: đây là thế hệ dự kiến có tính năng vượt trội, như hệ thống Helicos Biosciences' Heliscope của Helicos Biosciences dự kiến là hệ thống giải trình tự ADN thế hệ thứ III đầu tiên được thương mại hóa vào cuối năm 2010 (next-next generation sequencing).
  

Kể từ năm 1977 khi Sanger và cộng sự bằng phương pháp giải trình tự kết thúc chuỗi đã giải mã thành công hệ gen ADN của sinh vật đầu tiên là thực khuẩn thể Φ-X174 có kích thước hệ gen tương đối nhỏ (5386bp), đã mở ra thời kỳ giải mã hệ gen của các sinh vật sống trên thế giới. Tuy nhiên, do hạn chế về kĩ thuật nên trong 2 thập kỷ tiếp theo chỉ có các sinh vật có kích thước hệ gen nhỏ được giải mã hoàn thiện như các vi khuẩn hay virus gây bệnh. Cho đến cuối thập niên 90, mới có giun tròn là sinh vật đa bào đầu tiên có hệ gen được giải mã. Riêng với hệ gen người, chương trình giải mã hệ gen người được manh nha từ đầu thập niên 80 của thế kỷ trước tại Mỹ và chính thức được thực hiện từ năm 1990 với nguồn quỹ của Bộ Năng lượng và Viện sức khỏe quốc gia Mỹ (quỹ ban đầu là 3 tỷ USD để giải mã hệ gen người trong 15 năm) [3], [6], [7]. Tuy nhiên, thời kỳ đầu dự án tiến triển rất chậm chạp, hầu như không có tiến bộ đáng kể nào được công bố do hạn chế của thiết bị và phương pháp tiếp cận. Đến năm 2000, nhờ sự ra đời của máy giải trình tự ADN thế hệ I nâng cấp cùng với các siêu máy tính và phần mềm tin học, dự án gen người đã tăng tốc, phiên bản đầu tiên của bộ gen đã được công bố bởi tổng thống Mỹ Bill Clinton và Thủ tướng Anh Tony Blair vào ngày 26 tháng 6 năm 2000 [41]. Hầu hết dữ liệu quan trọng đạt được vào giai đoạn cuối, đến tháng 4 năm 2003 (sớm hơn 2 năm so với dự tính) phiên bản hoàn thiện đã được công bố dự án gen người của chính phủ Mỹ và công ty tư nhân Celera. Sau đó, tổng thống Mỹ quyết định công bố toàn bộ dữ liệu hệ gen người cho toàn thế giới cùng sử dụng. Sau thành công của dự án hệ gen người hàng loạt dự án giải mã hệ gen ở các sinh vật khác được khởi động và tái khởi động với hàng loạt các mục tiêu đề ra nhằm cải thiện hiểu biết cơ bản của chúng ta về sự sống của chính con người và sinh giới: tiến hóa, tổ chức và chức năng của các gen và đồng thời làm cơ sở cho việc dự báo di truyền, cảnh báo bệnh, bảo tồn và tạo ra các giống cây, con có ưu thế với nhu cầu ngày càng đa dạng của con người [39].

Tương tự như động vật, chương trình giải mã hệ gen ở các loài thực vật quan trọng cũng đã được tiến hành như dự án giải mã hệ gen lúa Indica của trung quốc, dự án giải mã hệ gen ngô của Mỹ, dự án giải mã hệ gen nho của Pháp và Ý. Hiện nay, theo công bố chính thức thì đã có các cây trồng sau được giải mã hệ gen:

• 
  Lúa Indica, hệ gen kích thước khoảng 420 Mb gồm khoảng 32-50.000 gen, hoàn thành năm 2002 bởi viện nghiên cứu gen Bắc Kinh và Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc [35].
  
• 
  Lúa Japonica, hệ gen kích thước khoảng 466 Mb, gồm khoảng 46.022-55.615 gen, hoàn thành năm 2002 bởi công ty Syngenta và Myriad [13].
  
• 
  Nho PN40024, hệ gen kích thước khoảng 490 Mb, gồm khoảng 30.434 gen hoàn thành năm 2007 bởi sự hợp tác giữa Pháp và Ý [19].
  
• 
  Giống đu đủ “Sun up”, hệ gen kích thước khoảng 372 Mb gồm khoảng 28.629 gen hoàn thành năm 2008 bởi trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Hawaii [23].
  
• 
  Giống ngô B73, hệ gen kích thước khoảng 2.800 Mb gồm khoảng 32.000 gen hoàn thành năm 2009 bởi viện NSF [27].
  
• 
  Giống dưa chuột dài (dòng 9930), hệ gen kích thước 367 Mb gồm khoảng 26.682 gen hoàn thành năm 2009 bởi viện Hàn Lân khoa học Nông nghiệp Bắc Kinh, Trung Quốc [17].
  
• 
  Gần đây nhất là đậu tương với hệ gen 1100 Mb gồm khoảng 46.430 gen được công bố năm 2010 bởi đại học Purdue, Mỹ [18].
  

Lúa được cho là cây lương thực quan trọng nhất của thế giới và do kích thước bộ gen của nó nhỏ so với các loại ngũ cốc khác. Lúa đã được chọn là loài cây trồng mô hình cho việc giải mã bộ gen đầy đủ. Dự án giải trình tự hệ gen lúa gạo (IRGSP) bao gồm nhiều phòng thí nghiệm từ mười quốc gia khác nhau đã giải trình tự dựa trên bản đồ chất lượng cao của 12 nhiễm sắc thể của giống lúa 'Nipponbare'.

Dự án IRGSP được thành lập năm 97 nhằm giải trình tự hệ gen giống lúa Nipponbare với chiến lược giải trình tự nhân dòng lần lượt (clone by clone) dựa trên bản đồ chất lượng tốt của 12 NST của giống lúa này. Để xây dựng trình tự dựa trên bản đồ vật lý có sẵn, 2 phương án tiếp cận đã được sử dụng. Nhóm nghiên cứu hệ gen (RGP) tại Nhật đã gắn các clone của hệ gen bằng cách sử dụng các vị trí EST/STS (Expressed Sequence Tags/Sequence Tagged) và các dấu chuẩn từ bản đồ di truyền và bản đồ phiên mã của lúa [41], [14]. Viện nghiên cứu hệ gen của đại học Clemson, Viện nghiên cứu hệ gen Arizona sử dụng một hệ thống hiệu suất cao dấu vân tay các nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC) và hệ thống lắp ghép tự động các BAC thành các contig bằng phần mềm FPC [28] và gắn các contig với hệ gen lúa bằng việc sàng lọc dựa trên các phép lai [4]. Trình tự được tạo ra dựa trên bản đồ vật lý có sẵn theo 2 hướng trên đã bao phủ 95% hệ gen của lúa, và từ 92%-100% đối với từng NST. Có tổng cộng 3453 BAC đã được sử dụng để xây dựng hệ thống này. Tháng 12 năm 2002, một trình tự nháp chất lượng tốt với kích thước khoảng 336 Mb đã được công bố. Cho đến tháng 12 năm 2004, trình tự hoàn chỉnh có kích khoảng 370 Mb bao phủ khoảng 95% hệ gen, khoảng 99% vùng NST thật đã được hoàn thành và đến ngày 11 tháng 8 năm 2005 đã công bố trên tạp chí Nature và công khai cho tất cả những ai có nhu cầu sử dụng. Trình tự này cũng bao hàm 3 trình tự của vùng trung tâm, các vùng rDNA, các vùng chứa các yếu tố di truyền vận động khác nhau (chiếm đến 35% kích thước hệ gen). Trình tự này hiện nay được coi là chuẩn mực vàng (gold stADNard) cho các nghiên cứu về hệ gen của lúa.

Một chiến lược khác cũng được sử dụng giải trình tự ngẫu nhiên (shot-gun) toàn bộ hệ gen đã được sử dụng bởi nhiều dự án khác. Trong chiến lược này, một chương trình hiệu suất cao sẽ sắp xếp hàng triệu trình tự shot-gun thành trình tự hệ gen hoàn chỉnh. Hai nhóm độc đã sử dụng phương pháp này là Viện nghiên cứu hệ gen Bắc Kinh trên giống lúa indica 93-11 và công ty Syntagen (Basel, Thụy Sỹ) trên giống lúa Nipponbare [35], [17] (Đây cũng là chiến lược đã được sử dụng trong việc giải trình tự 2.9 Gb hệ gen người [32]).

Để biết được thực sự có bao nhiêu gen trong hệ gen của lúa, cần phải có các trình tự các cDNA hoàn chỉnh cùng với thông tin về các codon mở đầu và codon kết thúc mà không bị ngắt quãng. Trình tự hệ gen hoàn chỉnh sẽ cung cấp các thông tin thống kê cần thiết để xác định các điểm ghép nối. Một vài chương trình dự đoán đã được phát triển sử dụng cho từng hệ gen thực vật khác nhau, với cây lúa chương trình FGENESH đã được sử dụng để phân tích tổng số gen và mô hình hóa cấu trúc gen. Nếu không tính các yếu tố di truyền vận động, hệ gen của lúa chứa khoản 45 nghìn trình tự mã hóa protein, mật độ gen tương ứng là 1 gen/8200bp. Nhiễm sắc thể số 1 và số 3 là những NST giàu gen nhất trong khi NST số 12 lại là NST ít gen nhất. Việc giải trình tự hệ gen cũng cung cấp câu trả lời quan trọng về cấu trúc hệ gen của lúa. Các gen liền nhau có rất nhiều trong cả 12 NST . Mật độ cao các gen đa bản trong hệ gen của lúa chưa từng được biết đến trong các bộ gen khác kể cả cây mô hình Arabidopsis thaliana. Bên cạnh đó người ta còn thấy một tần số thấp của việc cắt nối trong hệ gen của lúa khi so sánh trình tự hệ gen với các cDNA hoàn chỉnh. Có lẽ điều này là cần thiết cho cây lúa trong việc chuẩn bị một tập hợp gen cho một bản phiên mã tương tự trong điều kiện nào đó. Các nghiên cứu sâu hơn về promoter sẽ làm sáng tỏ câu hỏi bằng cách nào và khi nào các gen tương đồng đa bản này được biểu hiện ở từng loại mô khác nhau ở lúa.

Trình tự hoàn chỉnh của hệ gen lúa còn được ứng dụng trong công tác chọn giống. Dựa vào trình tự hệ gen của lúa, chúng ta có thể kiểm soát tính di truyền các tính trạng nông học và cung cấp các công cụ cho công tác cải tiến giống cây trồng. Hầu hết các tính trạng nông học được kiểm soát đa gen và cơ chế di truyền số lượng phức tạp. Do đó, các nỗ lực đều tập trung vào việc phân lập các QTL (Quantitative Trait Loci) liên kết với các tính trạng có giá trị. Các allen QTL có giá trị kinh tế đều đã được đánh dấu bằng các marker ADN và đã được chuyển vào các giống lúa ưu tú theo phương pháp chọn lọc nhờ dấu chuẩn phân tử (Marker Assisted Selection - MAS). Các allen QTL là nguồn biến dị di truyền hữu dụng và không bị giới hạn khi áp dụng cho các sản phẩm nông nghiệp, hiện đã có khoảng 8000 QTL được phát hiện và được tập hợp trên cơ sở dữ liệu Gramme – QTL, Một yếu tố quyết định thành công trong việc xác định và sử dụng các QTL cho các tính trạng nông học là mức độ ảnh hưởng của kiểu gen so với ảnh hưởng của môi trường. Một vài QTL có ảnh hưởng lớn đã được nhân dòng bằng chiến thuật dựa trên bản đồ, ví dụ điển hình là QTL quy định số lượng hạt [2]. Tuy nhiên việc lập bản đồ chính xác các allen QTL vẫn còn là một thách thức cho dù tính trạng đã được đặc trưng hóa bởi nhiều nhà nghiên cứu khác nhau [33]. Nguyên nhân chính của vấn đề là khả năng phát hiện thấp của việc phân tích QTL bằng việc sử dụng quần thể F₂ và các dòng cận giao phối tái tổ hợp (Recombinant inbred Lines - RIL). Để khắc phục hạn chế của việc lập bản đồ dựa trên quần thể truyền thống người ta đã phát triển các dòng thay thế các đoạn NST (Chromosome Segment Substitution Line – CSSL). Khi có sự khác biệt về kiểu hình giữa một CSSL và cây bố mẹ người ta có thể xác định ngay vùng NST có chứa QTL vì mỗi CSSL thường chỉ có chứa một mảnh NST của cây cho [1], [8], [16], [31]. Bằng cách sử dụng CSSL Fukuoka và cs đã xác định QTL pi21 quy định tính kháng đạo ôn gồm 12 allen và chỉ có những cây thiếu 2 allen trở lên mới có khả năng kháng và các allen này có mặt trong một số giống Japonica điều này có thể giúp cải thiện việc kháng đạo ôn của lúa trên thế giới [11] [12]. Bên cạnh đó, CSSL còn rút ngắn thời gian trong việc xác định mối tương tác giữa các QTL đặc biệt là các trường hợp có mức độ nhiễu cao do đồng dạng di truyền bằng cách sử dụng con cháu của cặp lai giữa các CSSL có chứa các QTL quan tâm [34]. Tuy vậy, khả năng của các nghiên cứu sử dụng CSSL lại phụ thuộc vào việc xác định và mức độ sẵn sàng của các dòng cho, điều này phụ thuộc vào việc chúng ta phải phân tích cấu trúc di truyền của các giống lúa qua phân tích RFLP toàn bộ hệ gen. Việc giải trình tự toàn bộ hệ gen sẽ giúp chúng ta đánh giá mức độ đa dạng di truyền toàn hệ gen nhanh và chuẩn xác hơn, xác định được các dòng cho để từ đó xác định ý nghĩa của từng allen cũng như giải thích các tính trạng nông học phức tạp ở lúa.

Hiện nay, các trình tự SSR vẫn là một nguồn dấu chuẩn ADN quan trọng trong phân tích di truyền và chọn giống lúa, nhưng các đa hình đơn nucleotide (SNPs) sẽ trở thành một nguồn dấu chuẩn di truyền thường gặp nhất của đa hình ADN. Sau khi chi tiết trình tự hệ gen lúa được IRGSP công bố năm 2005, các SNPs giữa giống Nipponbare và 2 giống lúa indica (93-11 và GLA3) đã được công bố [9], [15], [37]. Với sự sáng tạo về công nghệ trong các máy giải trình tự hiệu năng cao, thông tin về SNPs giữa các giống lúa có thể được xác định nhanh và chi phí thấp. Gần đây, với việc giải trình tự lại 20 giống lúa Japonica và Indica 160.000 SNPs đã được xác định [36], điều này cho phép chúng ta đưa được một lượng lớn các QTL ở mức độ chi tiết vào chương trình chọn giống. Việc sự dụng các SNPs có thể xác thực hiệu quả của việc lập bản đồ kết hợp toàn bộ hệ gen (Genome Wide Association Mapping - GWA) trong việc phát hiện các nguồn tài nguyên di truyền tự nhiên có giá trị kinh tế [25]. Việc tập hợp thông tin về SNPs sẽ giúp chúng ta trong việc lập kế hoạch cho chương trình chọn giống và phát hiện tái tổ hợp xảy ra giữa các khối haplotype (các cá thế có SNPs). Để có được số lượng SNPs đủ cho mục tiêu này, chúng ta phải giải trình tự toàn bộ hệ gen của các giống đại điện để xây dựng được một cơ sở dữ liệu dựa trên các SNPs toàn bộ hệ gen để chọn lọc các SNPs và xác định tần số SNPs trong quần thể. Dữ liệu SNPs đầy đủ của hệ gen sẽ tạo điều kiện cải tiến cây lúa một cách hiệu quả khi kết hợp với hệ thống chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS) [34].

Ngoài ra, khả năng sử dụng dữ liệu hệ gen lúa phụ thuộc vào hiệu quả của cơ sở thông tin hạ tầng bởi dữ liệu về hệ gen lúa tăng theo cấp số nhân theo từng ngày do sự nỗ lực của rất nhiều nhà khoa học. Trình tự hệ gen là nền tảng cho các phân tích phía sau như: xác định từng gen, dự đoán các protein mà gen đó quy định, xác định khi nào và ở đâu gen đó biểu hiện và sự tương tác với từng điều kiện cụ thể. Vì vậy, cần phải kết nối nhiều nguồn thông tin khác nhau dựa trên một trình tự hệ gen lúa tiêu chuẩn. Hiện nay, các nghiên cứu giải trình tự hệ gen các giống lúa vẫn đang tiếp tục để làm rõ bức tranh về bản chất hệ gen của cây lúa.

2.8.Phương pháp giải trình tự bằng hệ thống Illumina.

Công nghệ giải trình tự tổng hợp (SBS) của Illumina hiện nay là một nền tảng thành công nhất và được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống máy giải trình tự thế hệ II trên thế giới hiện nay. Công nghệ của Illumina được cấu thành dựa trên quyền sử dụng hai phát minh quan trọng là công nghệ nano của nhóm Oxford Nanopore Technologies và công nghệ giải trình tự trên sợi ADN trong quá trình tổng hợp của Solexa. Sự kết hợp hai phát minh này trong công nghệ SBS cho phép Illumina sở hữu độc quyền công nghệ giải trình tự ngang hàng ADN quy mô lớn. Công nghệ nano của nhóm Oxford Nanopore Technologies cho phép Illumina gắn hàng loạt các oligonucleotide ngẫu nhiên trên diện tích rất nhỏ và đầu dò (camera) có thể thu nhận tín hiệu riêng biệt của từng oligonucleotide.

Để giải trình tự bằng hệ thống Illumina chúng ta cần tạo ra một thư viện các phân mảnh đại diện cho mẫu genome cần giải trình tự, đây là giai đoạn chuẩn bị mẫu . Trước hết các mẫu DNA quan tâm sẽ bị cắt thành các phân mảnh có kích thước thích hợp (trung bình 400 ~ 500bp) bằng cách sử dụng một thiết bị cắt bằng sóng âm. Các đầu tận cùng của các phân mảnh DNA được làm bằng, và hai trình tự adapter đặc hiệu được gắn vào các phân mảnh theo quy trình của hãng (Genomic DNA Sample Prep Kit). Tổng thời gian cho quá trình này ít hơn 6 giờ và thời gian thao tác chỉ có 3 giờ.

Khác với hệ thống 454 và hệ thống của ABI sử dụng một phản ứng PCR dựa trên hạt nhũ tương để tạo ra "polonies", Illumina sử dụng một phản ứng duy nhất "cầu nối" khuếch đại xuất hiện trên bề mặt của tế bào dòng chảy (flow cell), về cơ bản là một tấm kính rất nhỏ có khả năng bám nước rất chặt để cung cấp một diện tích bề mặt lớn cho hàng ngàn phản ứng hóa học song song có thể xảy ra trên đó. Giai đoạn này gồm 5 bước có thể tạm dịch là giai đoạn tạo ra các cụm bằng phương pháp khuếch đại cầu (bridge amplification) trên hệ thống chuyên biệt Cbot cluster generation system (tạm dịch là hệ thống tạo các cụm Cbot). Với hệ thống Cbot tổng thời gian cho giai đoạn này chỉ hết 4 giờ trong đó thao tác chỉ hết 10 phút.

Các dòng tế bào bề mặt được phủ chuỗi đơn oligonucleotides tương ứng với các trình tự của các adapter đã gắn với các phân mảnh trong giai đoạn chuẩn bị mẫu. Các phân mảnh sợi đơn đã gắn với adapter được liên kết với bề mặt của tế bào dòng chảy; được tiếp xúc với các chất phản ứng và được mở kéo dài trên enzyme polyermase. Mồi để xảy ra phản ứng tổng hợp chính là trình tự chuỗi đơn oligonucleotide đã gắn trên bề mặt tế bào dòng chảy. Quá trình lặp đi lặp lại việc biến tính và mở rộng dẫn đến việc khuếch đại tại chỗ một phân tử thành hàng triệu phân tử tại từng vị trí duy nhất trên bề mặt tế bào. Quá trình này xảy ra trong những gì được gọi là "trạm cluster" của Illumina (một dòng tế bào xử lý tự động).

Quá trình giải trình tự trong khi tổng hợp được tiến hành trên hệ thống máy Illumina cũng theo nguyên lý gắn mầu huỳnh quang cho nucleotide cuối cùng như trên máy giải trình tự thế hệ I nhưng với sự khác biệt là đầu dò có thể thu nhận tín hiệu huỳnh quang của từng loại nucleotide riêng biệt khi gắn vào từng cụm các trình tự (cluster hay còn được gọi là polony) nên phương pháp này còn được gọi là giải trình tự xúc xích (polony sequencing) trong quá trình tổng hợp. Ưu điểm của hệ thống Illumina là không bị hạn chế về số lượng cụm được giải trình tự tuy nhiên lại bị hạn chế về độ dài của phản ứng khuếch đại cầu. Với thế hệ máy Illumina mới nhất độ dài đã được nâng lên đến 100bp mỗi chiều và hiệu suất của hệ thống là sau 8 ngày có thể giải trình tự tổng cộng từ 150-200Gb.

Giai đoạn cuối cùng sẽ sử dụng phần mềm chuyên biệt (RTA version 1.7 và CASAVA version 1.7) để sắp xếp các trình tự riêng biệt thành một trình tự thống nhất của hệ gen. Giai đoạn này tùy theo kích thước hệ gen và trình tự tham khảo có sẵn hay không, thông thường với hệ gen như của người hệ thống mất 2 ngày và với 30 phút thao tác. Người ta đã từng đặt câu hỏi về khả năng của các hệ thống giải trình tự ngang hàng khi so sánh với phương pháp giải trình tự truyền thống (Sanger), tuy nhiên Takasi và cs khi tiến hành giải trình tự lại một vùng 800-kb ở vai ngắn của NST số 6 của giống lúa Nipponbare bằng hệ thống của Roche, đã chứng minh phương pháp này chính xác đến 99.95%. Các tác giả cũng cho rằng khi kết hợp đúng đắn các phương pháp giải trình tự thế hệ mới với các phương pháp hiện tại (cơ sở dữ liệu có sẵn) sẽ tạo ra một cuộc cách mạng về giá thành và hiệu quả giải trình tự lại hệ gen lúa và sẽ làm sáng tỏ quá trình tiến hóa của lúa gạo hiện nay từ các loài lúa hoang dại [30].

2.9 Các phương pháp tách chiết ADN

Phân tích sinh học phân tử được bắt đầu từ việc thu nhận dịch chiết ADN từ tế bào sống đủ sạch để thực hiện các phân tích tiếp theo. Tuỳ theo vật liệu nghiên cứu mà có phương pháp tách chiết ADN phù hợp. Dung dịch ADN sau khi kiểm tra hàm lượng và độ sạch được sử dụng để phân tích theo những mục đích khác nhau như Southem blot, Northem blot, PCR, RFLP, AFLP,...và xác định trình tự ADN. Điều quan tâm hàng đầu là các kĩ thuật tách chiết axit nucleic để thu nhận các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học hoặc hoá học. Tất cả các phương pháp đều thực hiện theo nguyên lý cơ bản sau:

* Nguyên tắc

Để tiến hành tách ADN từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa ADN. Tủa sau khi thu được được hòa tan lại trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy theo mục đích nghiên cứu. Khác với tách mô động vật, khi tách mô thực vật thì ta phải tiến hành loại bỏ đường (thành phần có nhiều trong mô thực vật). Để loại bỏ đường, chủ yếu dùng phương pháp tách CTAB tức là dùng dung dịch đệm CTAB để tách ADN ra khỏi mô thực vật. Chất này chỉ hòa tan ADN chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà có thể loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách ADN.

* Các bước tiến hành

- Phá bỏ màng tế bào và màng nhân: Người ta có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa học hay cơ học (phương pháp cơ học, nghiền nát bằng máy xay trong nitơ lỏng).

- Chiết ADN và loại bỏ protein: Sau khi phá bỏ màng tế bào thì dùng dung dịch đệm CTAB để hòa tan ADN. Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và ARN nên để thu nhận được ADN tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và ARN. Ở đây thường dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch có chứa ADN. Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa hai pha nước và pha chloroform.

- Kết tủa ADN: Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và ADN rồi sau đó hòa tan ADN trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trong dung dịch này.

- Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN: Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa ADN bằng etanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa ta có thể pha thêm dung dịch muối CH3COONa 3M (2 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa. Ngoài ra còn có thể tủa bằng isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần tủa. Muối lẫn trong ADN sẽ ảnh hưởng đến kết quả các thí nghiệm sau này nên người ta thường tiến hành rửa tủa ADN bằng dung dịch ethanol 70%.

Genome chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể hoạt động. Ở các sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% genome nằm trong nhân tế bào và phần còn lại nằm trong một số cơ quan tử như ty thể và lạp thể. Trình tự genome của những sinh vật mô hình rất có ý nghĩa trong những nghiên cứu của một chuyên ngành khoa học mới đó là genome học (genomics). Dựa vào đây, các nhà sinh học phân tử có thể phân tích cấu trúc, hoạt động và chức năng của các gen, làm sáng tỏ được vai trò của DNA lặp lại, DNA không chứa mã di truyền. Điều đặc biệt có ý nghĩa là khi so sánh các genome với nhau, có thể hiểu được hoạt động của genome trong các cơ thể sống, mối quan hệ giữa chúng, sự đa dạng sinh học và mức độ tiến hóa. Do vậy chúng ta cần phải tìm phương pháp tối ưu nhất để tách chiết được toàn bộ genome của chúng mà không bị đứt gãy trong quá trình thao tác để trong quá trình giải trình tự không bị rối và nhiễu.

Để xây dựng thư ADN hệ gen, có nhiều phương pháp phải được phát triển để phân lập ADN phân tử lượng rất lớn - kích thước megabase từ thực vật. Để phân lập lượng ADN như vậy, protoplasts hoặc nhân trước tiên phải được nhúng vào trong nút thạch agarose hoặc microbeads. Thạch agarose đóng vai trò như là một lưới cứng vững chắc đồng thời có các lỗ xốp cho phép khuếch tán của các chất phản ứng khác nhau để tinh chế ADN và những thao tác sau đó trong khi ngăn chặn hiện tượng biến dạng DNA. Microbeads được sử dụng nhiều hơn các nút thạch do sử dụng các hạt tăngdiện tích bề mặt xung quanh các mẫu mô khoảng 1000 nếp gấp do đó cho phép sự khuếch tán nhanh và hiệu quả hơn là đưa hóa chất và enzyme vào và ra khỏi các hạt agarose. Sau khi nhúng, protoplasts hoặc nhân được phân giải và loại protein đã biến tính với sự hiện diện của 0,5M EDTA 1% sarcosyl, và 0,1-1,0 mg/ml proteinase-K ở 50⁰ C. Sau khi ly giải tế bào và sự thoái hóa protein, ADN còn lại là phù hợp với những tác động biến đổi gây ra bởi enzym. Hầu hết các quy trình tách chiết ADN kích thước megabase từ cây cỏ sử dụng phương pháp này [5]. Mặc dù phương pháp protoplast tách được lượng lớn DNA megabase chất lượng cao, nhưng quá trình này lại tốn kém và tốn nhiều công lao động. Một ví dụ là để chuẩn bị tách protoplasts từ cà chua, lá non được cạo sạch lông với một lưỡi dao cạo trước khi được ủ 4-5 giờ với các enzyme phân hủy thành vách tế bào. Với cây lúa miến, Woo và cs (1995) tìm thấy cách tốt nhất để tạo ra lượng lớn . Protoplasts để tách DNA megabase là để chà carborundum trên cả hai mặt của lá cây với một cây cọ, 50 vết mỗi bên, trước khi ủ 4-5 giờ với emzyme cellulysin. Do đó, lượng thời gian trước khi nhúng trong agarose có thể lên tới 7-9 tiếng, tùy thuộc vào lượng nguyên liệu lá được xử lý. Hơn nữa, vì mỗi loài thực vật đòi hỏi một tập hợp các điều kiện khác nhau để tạo ra protoplasts, phương pháp chỉ hiệu quả nếu được nghiên cứu thiết kế đặc trưng cho từng loài thực vật.

Một số nhà nghiên cứu đã thử nghiệm tách ADN kích thước megabase từ nhân với mức độ thành công khác nhau: Mô tươi hoặc đông lạnh được đồng nhất với một máy xay hoặc cối và chày. Nhân sau đó bị tách và nhúng như trên. Chất lượng của ADN tốt tương đương ADN tách từ protoplasts, thường đậm đặc hơn, và có chứa một lượng thấp hơn của ADN lục lạp. Ưu điểm chính của phương pháp này là kinh tế và không mất nhiều công lao động như các phương pháp tách từ lục lạp. Thời gian cần để tách DNA nhân và gắn trên thạch thường ít hơn 2 giờ.

Năm 1997, Peterson và cộng sự đã xây dựng một qui trình tách chiết ADN để thu được nồng độ ADN lớn và độ tinh sạch cao từ cây cà chua. Quy trình có những đặc điểm đặc trưng phù hợp để sử dụng trong việc xây dựng thư viện ADN cũng như nhiều ứng dụng sinh học phân tử khác:

1. 
   Trước khi đồng nhất hóa, mô được được xử lý với ether để làm nhân dễ vỡ vụn hơn. Xử lý bằng ether làm tăng đáng kể lượng nhân [38]. Quá trình đồng nhất được thực hiện sử dụng máy trộn đơn giản.
   
2. 
   Đệm phân lập nhân (MEB) được thiết kế để xử lý các vấn đề thường gặp trong quá trình tách chiết ADN thực vật. Đầu tiên, đệm có chứa 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD), một chất giúp ổn định nhân và ngăn quá trình phân giải trước trưởng thành (premature). Lượng nhân thu được sử dụng MEB cao hơn 10 lần so với đệm chỉ sử dụng sucrose [24]. Đệm cũng có chứa chất chống oxi hóa beta-mercaptoethanol, sodium diethyldithiocarbamate và sodium metabisulfite. Các chất này hạn chế sự oxi hóa của các polyphenols. Ở dạng đã oxy hóa, polyphenols tạo liên kết đồng hóa trị với ADN làm chuyển thành màu nâu và không còn sử dụng được. Polivinylpyrrolidone trong đệm hấp phụ các chất polyphenolic ngăn nó tương tác với ADN L-lysine và EGTA ngăn enzyme nội sinh tiêu hủy ADN.
   
3. 
   pH thấp của đệm (pH 6.0) ngăn quá trình oxi hóa polyphenol. Sau khi đồng nhất hóa, thêm triton X-100 với nồng độ 0.5% tác dụng ưu tiên phân giải lục lạp và ti thể. Sự có mặt của cation hóa trị 2 (Mg2+) trong MEB ngăn sự phân giải nhân gây ra bởi Triton X-100.
   
4. 
   Nhân được tách ra khỏi đám tạp vụn bằng cách ly tâm theo thang gradient Percoll. Các bước ly tâm tốc độ thấp được dùng để loại bỏ một số (thậm chí là đa số) các hạt tinh bột thường kết vón với nhân.
   

Một quy trình khác đã được sử dụng để xây dựng thư viện ADN từ nhiều loài trong đó có Lúa, Lúa miến, Lúa mì, Mía, Vải, Đỗ tương, Lúa mạch và Arabidopsis. Trong qui trình này, mô thực vật được nghiền trong Nitơ lỏng. Hỗn hợp được đồng nhất trong đệm chứa sucrose (SEB). Triton X-100 được thêm vào để phá hủy lục lạp và ti thể, hỗn dịch được lọc nhiều lần để loại bỏ phần lớn vụn tế bào và nhân được thu lại bằng cách ly tâm. pH cao của SEB (pH 9.1) ức chế hoạt động của enzyme nội bào. Sự có mặt của beta-mecarptoethanol và PVP trong SEB làm trung hòa một số tác dụng âm tính của polyphenol oxi hóa. Qui trình này đã được sử dụng để phân lập ADN kích thước dài hàng triệu bp từ cây một lá mầm và một số ít cây hai lá mầm. Phương pháp đặc biệt thích hợp với các loài/mô có chứa ít các sản phẩm chuyển hóa bậc hai hoặc carbohydrates. Hạn chế của qui trình này là lượng ADN nhân thu được ít hơn, nhiễm bẩn các chất tạp trong quá trình phân lập như vụn tế bào, carbohydrates và khả năng kiểm soát polyphenol kém hơn.