III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU

- Vật liệu thực vật: Vật liệu nghiên cứu gồm 30 giống lúa bản địa ưu tú của Việt nam có các đặc tính nông sinh học quí được tuyển chọn từ 6 tập đoàn khác nhau (chất lượng tốt, kháng đạo ôn, bạc lá, rầy nâu, chịu mặn, chịu hạn) (bảng 1).

1. 
   Tris 1M pH8.0 1L (Tris: 121.1g hòa tan trong H2O, pH 8.0,autoclave).
   
2. 
   Potassium chloride (KCl) 2.5M 1L (372.75g KCl hòa tan trong H2O, ,autoclave)
   
3. 
   EDTA 0.5M 1L (EDTA: 292.24g hòa tan trong H2O, autoclave)
   
4. 
   Sucrose 1.1M 2L (Sucrose: 753.06g hòa tan trong H2O, khử trùng bằng màng lọc 0.22µM)
   
5. 
   Spermidine trihydrochloride 1M (5g Spermindine hòa tan trong 19.66ml H2O Bảo quản -20^oC)
   
6. 
   Spermine tetrahydrochloride 0.5M (5g Spermine, hòa tan trong 28.72ml H₂O, Bảo quản -20^oC)
   
7. 
   Carbamic acid (65 mg ml^-1) 1L(Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate) ( 32.5g carbamic acid hòa tan trong H2O, khử trùng bằng màng lọc 0.22µM)
   
8. 
   PVP40 (50 mg ml-1) 500ml (25g PVP40 hòa tan trong H₂O, khử trùng bằng màng lọc 0.22µM)
   
9. 
   2-Mercaptoethanol (β-mercaptoethanol)
   
10. 
    Triton X-100
    
11. 
    SDS 20% (10g SDS hòa tan trong 50ml H₂O)
    
12. 
    5M Sodium perchlorate (NaClO₄) 175.6g NaClO4 hòa tan trong 250ml H2O khử trùng bằng màng lọc 0.22µM)
    
13. 
    Proteinase K 10mg ml^-1
    
14. 
    RNase A 10 mg ml-1
    

1 - NEB 1L

1. 
   Thu 30g lá lúa, nghiền mịn trong ni tơ lỏng,
   
2. 
   Bổ sung 450ml SEB-M lạnh,
   
3. 
   Ủ trên đá 10 phút, khuấy nhẹ
   

5. Bổ sung 1/20 thể tích SEB-MT (có chứa Triton). Ủ trên đá 10 phút, khuấy nhẹ

6. Li tâm 650 x g, 10 phút, 4^oC trong ống 250ml.

7. Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 20ml SEB-M

8. Li tâm ở 650 x g, 10 phút, 4^oC trong Falcon 15ml.

9. Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 20ml SEB-M

10. Li tâm ở 650 x g, 10 phút, 4^oC trong Falcon 15ml.

11. Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 7,5 ml SEB-M

12. Bổ sung 20% SDS (w/v) (đến nồng độ cuối cùng là 2% ). Đảo nhẹ đều

13. Ủ trong bể ổn nhiệt 60^oC trong 10 phút, để về nhiệt độ phòng

14. Bổ sung 5M sodium perchlorate (20^oC) đến nồng độ cuối cùng là 1M

15. Li tâm 400 x g trong 20 phút để loại tinh bột

16. Thu dịch nổi

17. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ 15 phút.

18. Li tâm 3000 x g trong10 phút.

19. Thu dịch nổi

20. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ 15 phút. Thu dịch nổi

21. Chuyển sang màng thẩm tích, ngâm trong TE (pH7.0) ở 4^oC qua đêm.

22. Chuyển dịch từ màng sang falcon 15ml

23. Bổ sung RNase T1 50U/ml ADN RNase A 50 ug/ml , ủ ở 37^oC trong 45 phút

24. Bổ sung Proteinase K đến nồng độ 150 µg/ml ủ ở 37^oC trong 45 phút .

25. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ 15 phút

26. Li tâm ở 3000 x g trong 10 phút.

27. Chuyển dịch nổi sang ống15ml .

28. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ 15 phút , Li tâm ở 3000 x g trong 10 phút.

29. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc nhẹ 15 phút

30. Li tâm ở 3000 x g trong 10 phút.

31. Chuyển dịch nổi sang ống15ml

32. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc nhẹ 15 phút, Li tâm ở 3000 x g trong 10 phút , Chuyển dịch nổi sang ống15ml

33. Bổ sung 1/10 thể tích 3M sodium acetate (pH5.2)

34. Chuyển sang ống li tâm đáy tròn.

35. Bổ sung 2-2.5 thể tích100% ethanol và lắc nhẹ

36. Li tâm 14,000 RPM trong 30 phút ở 4^oC

37. Rửa bằng 1ml 70% ethanol, Li tâm 14,000 RPM trong 15 phút ở 4^oC

38. Loại bỏ dịch và để khô ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

39. Hòa tan ADN bằng 500µl H₂O.

3.2.2. Phương pháp kiểm tra chất lượng ADN

• 
  Kiểm tra chất lượng ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%
  
• 
  Đo nồng độ ADN và độ tinh sạch (OD 260/280) bằng máy đo quang phổ
  
• 
  Kiểm tra chất lượng ADN bằng phương pháp ADN chip Analyzer (thí nghiệm này được thực hiện tại Trung tâm Phân tích genome, Vương quốc Anh)
  

Sau khi tách chiết ADN được hòa tan bằng nước cất vô trùng khử Ion. Lấy 1µl mẫu ADN tổng số với 2µl loading dye để điện di so sánh với Ladder ADN 50 g/µl trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy rằng các băng ADN tổng số của các giống lúa thu được gọn, sáng đồng đều, không đứt gẫy hay lẫn tạp. Nồng độ ADN cao hơn so với Marker ADN (50 g/µl).

ADN tổng số được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy quang phổ. Lấy 70µl ADN tổng số đã tan hoàn toàn trong nước cất vô trùng khử Ion để vào cuvet và đo với hai bước sóng OD260 và OD280. Kết quả được tổng hợp trong bảng 2.

Thí nghiệm kiểm tra chất lượng ADN được thực hiện tại Trung tâm Phân tích genome, Vương Quốc Anh với các bước như sau:

• 
  Pha loãng mẫu ADN đến cùng nồng độ 20g/µl
  
• 
  Lấy mỗi mẫu 55µl cho vào ống eppendorff mới và dán nhãn
  
• 
  Chuyển 52,5 µl mỗi mẫu ADN cho vào mỗi ống Covaris
  
• 
  Cắt đoạn ADN bằng sóng siêu âm của máy Covaris với các thông số như sau:
  

• 
  Li tâm 600xg trong 5 giây
  
• 
  Chuyển 50 µl các đoạn ADN của mỗi mẫu từ ống Covaris sang ống eppendorff mới và dán nhãn.
  
• 
  Lấy 1µl ladder và 1µl mẫu ADN của từng giống cho vào từng giếng của plate ADN chip. Sử dụng phần mềm ADN chip Analyzer để kiểm tra chất lượng ADN của từng mẫu. Kết quả kiểm tra của từng mẫu hiển thị trên đồ thị:
  

Sản phẩm ADN sau khi cắt đoạn được kiểm tra bằng phần mềm ADN chip Analyzer cho thấy kích thước đoạn cắt tập trung trong khoảng 400-500bp. Không thấy có những bit khác chứng tỏ ADN có chất lượng rất tốt không bị đứt gãy.

Mẫu ADN sau khi cắt đoạn được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho thấy: kích thước đoạn cắt trong khoảng 400-500bp, không có smear chứng tỏ ADN có chất lượng rất tốt.

• 
  Chúng tôi đã tách chiết và tinh sạch ADN của 30 giống lúa đạt tiêu chuẩn cho công tác giải mã hệ gen.
  
• 
  Hiện nay các mẫu ADN tinh sạch đã được gửi đến trung tâm TGAC, Vương quốc Anh và đã hoàn thành công việc giải mã hệ gen của từng giống lúa.
  

1. 
   ADNo T., Yamamoto T., Shimizu T., Ma X. F., Shomura A., Takeuchi Y., et al. (2008). Genetic dissection ADN pyramiding of quantitative traits for panicle architecture by using chromosomal segment substitution lines in rice. Theor Appl Genet 116: 881-890.
   
2. 
   Ashikari M., Sakakibara H., Lin S., Yamamoto T., Takashi T., Nishimura A., et al. (2005). Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science 309: 741-745.
   
3. 
   Barnhart B. J. (1989). DOE Human Genome Program. Human Genome Quarterly 1.
   
4. 
   Chen M., Presting G., Barbazuk W. B., et al. (2002). An integrated physical ADN genetic map of the rice genome. The Plant Cell 14 (3): 537-545.
   
5. 
   Cheung WY, MD Gale.1990. The identification of high molecular weight DNA from wheat, barley, ADN rye for analysis by pulsed field gel electrophoresis. Plant Mol. Biol. 14:881-888
   
6. 
   Cook D. R. (1989). The Alta Summit, December 1984 Genomics 5 (3): 661-663.
   
7. 
   Delisi C. (2001). Genomes: 15 Years Later A Perspective by Charles DeLisi, HGP Pioneer. Human Genome News 11: 3-4.
   
8. 
   Ebitani T., Takeuchi Y., Nonoue Y., Yamamoto T., Takeuchi K., Yano M. (2005). Construction ADN evaluation of chromosome segment substitution lines carrying overlapping chromosome segments of indica rice cultivar 'Kasalath' in a genetic background of japonica elite cultivar 'Koshihikari'. Breed Sci. 55: 65-73.
   
9. 
   Feltus F. A., Wan J., Schulze S. R., Estill J. C., Jiang N., Paterson A. H. (2004). An SNP resource for rice genetics ADN breeding based on subspecies indica ADN japonica genome alignments. Genome Res. 14: 1812-1819.
   
10. 
    Fiers W., Contreras R., Duerinck F., Haegeman G., Iserentant D., Merregaert J., Min J. W., Molemans F., Raeymaekers A., Van B. A., Volckaert G., Ysebaert M. (1976). Complete nucleotide sequence of bacteriophage MS2 RNA: primary ADN secondary structure of the replicase gene. Nature 260 (5551): 500-507.
    
11. 
    Fukuoka S., Okuno K. (2001). QTL analysis ADN mapping of pi21, a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese uplADN rice. Theor Appl Genet. 103: 185-90.
    
12. 
    Fukuoka S., Saka N., Koga H., Ono K., Shimizu T., Ebana K., et al. (2009). Loss of function of a proline-containing protein confers durable disease resistance in rice. Science. 325: 998-1001.
    
13. 
    Goff S. A., Ricke D., Lan T. H. (2002). A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 296 (5565): 92-100.
    
14. 
    Harushima Y., Yano M., Shomura A., et al. (1998). A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population. Genetics 148 (1): 479-494.
    
15. 
    Han B., Xue Y. (2003). Genome-wide intraspecific DNA-sequence variations in rice. Curr Opin Plant Biol. 6: 134-138.
    
16. 
    Hori K., Sugimoto K., Nonoue Y., Ono N., Matsubara K., Yamanouchi U., et al. (2010). Detection of quantitative trait loci controlling pre-harvest sprouting resistance by using backcrossed populations of japonica rice cultivars. Theor Appl Genet. 120:1547-57.
    
17. 
    Huang S., Li R., Zhang Z. (2010). The genome of the cucumber, Cucumis sativus L. Nature Genetic 41 (12): 1275-1280.
    
18. 
    Huang S., Li R., Zhang Z. (2010). Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature 463 (12): 178-183.
    
19. 
    Jaillon O., Aury J. M., Noel B. (2007). The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature 449 (7161): 463-467.
    
20. 
    Go S. A., Ricke D., Lan T. H., et al. (2002). A draft sequence of the rice genome (Oryzasativa L.ssp. japonica). Science 296 (5565): 92-100.
    
21. 
    Karl V., Shale A. D. ADN Jacob D. D. (2009). Next Generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics. Clinical Chemistry 55 (4): 41-47.
    
22. 
    Metzker M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet 11 (1): 31-46.
    
23. 
    Ming R., Hou S., Feng Y. (2008). The draft genome of the transgenic tropical fruit tree papaya (Carica papaya Linnaeus). Nature 452 (7190): 991-997.
    
24. 
    Peterson, D.G., Boehm, K.S. ADN Stack, S.M. (1997) Isolation of milligram quantities of ADN from tomato (Lycopersicon esculentum), a plant containing high levels of polyphenolic compounds. Plant Mol. Biol. Reptr., 15, 148-153.
    
25. 
    Rostoks N., Ramsay L., MacKenzie K., Cardle L., Bhat P. R., Roose M. L., et al. (2006). Recent history of artificial outcrossing facilitates whole genome association mapping in elite inbred crop varieties. Proc Natl Acad Sci USA103: 18656-18661.
    
26. 
    Sasaki T., Takashi M., Kimiko Y. et al. (2002). The genome sequence ADN structure of rice chromosome 1. Nature 420: 312-316.
    
27. 
    Schnable P., Ware D., Fulton R. S. (2009). The B73 Maize Genome: Complexity, Diversity, ADN Dynamics. Science 326 (5956): 1112-1115.
    
28. 
    Soderlund C., Longden I., ADN Mott R. (1997). FPC: A system for building contigs from restriction fingerprinted clones. Computer Applications in the Biosciences 13 (5): 523-535.
    
29. 
    Staden R. (1979). A strategy of ADN sequencing employing computer programs. Nucleic Acids Research 6 (7): 2601-2610.
    
30. 
    Takai T., Nonoue Y., Yamamoto S., Yamanouchi U., Matsubara K., Liang Z. W., et al. (2007). Development of chromosome segment substitution lines derived from backcross between indica donor rice cultivar ‘Nona Bokra’ ADN japonica recipient cultivar ‘Koshihikari’. Breed Sci. 57: 257-61. 
    
31. 
    Venter J. C., Smith H. O., ADN Hood L. (1996). A new strategy for genome sequencing. Nature 381 (6581): 364-366.
    
32. 
    Venter J. C., Adams M. D., Myers E. W., et al., (2001). The sequence of the human genome. Science 291 (5507): 1304-1351.
    
33. 
    Yamamoto T., Yonemaru J., Yano M. (2009). Towards the understADNing of complex traits in rice: substantially or superficially. DNA Res. 16: 141-154.
    
34. 
    Yamamoto T., Nagasaki H., Yonemaru J., Ebana K., Nakajima M., Shibaya T., et al. (2010). Fine definition of the pedigree haplotypes of closely related rice cultivars by means of genome-wide discovery of single-nucleotide polymorphisms. BMC Genomics 11: 267.
    
35. 
    Yu J., Hu S., Wang J., et al., (2002). A draft sequence of the rice genome (Oryzasativa L.ssp. indica). Science 296 (5565): 79-92.
    
36. 
    Yu J., Wang J., Lin W., et al. (2005). The genomes of Oryzasativa: a history of duplications. PLoSBiology 3 (2): 38.
    
37. 
    Wang E., Wang J., Zhu X., Hao W., Wang L., Li Q., et al. (2008). Control of rice grain-filling ADN yield by a gene with a potential signature of domestication. Nat Genet. 40: 1370-1374.
    
38. 
    Watson, J.C. ADN Thompson, W.F. (1986) Purification ADN restriction endonuclease analysis of plant nuclear ADN. Methods Enzymol., 118, 57-79.
    
39. 
    http://www.broad.mit.edu/mammals
    
40. 
    http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/alta.shtml
    
41. 
    http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/clinton1.shtml