ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực có khả năng chịu hạn kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài. Tính trạng chịu hạn là một tính trạng đa gen phức tạp, những nghiên cứu về sinh lý học đã chỉ ra rằng tính chịu hạn của lúa phụ thuộc vào các yếu tố sau: thứ nhất, khả năng đâm xuyên của rễ tìm nước dưới tầng đất sâu phục vụ nhu cầu nước của cây khi lớp nước trên bề mặt bị bốc hơi; thứ hai, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào lá giúp cây duy trì được sức căng bề mặt bảo vệ cho mô phân sinh khỏi bị mất nước; thứ ba, cơ chế điều khiển thoát hơi nước ở khí khổng (Nguyen & cs., 2000). Hiện nay, các nhà khoa học cho rằng có khoảng 200 gen tham gia vào cơ chế kháng hạn ở cây nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định.

Kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồn gen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương. Tuy nhiên, chưa có nhiều những phân tích, đánh giá đặc tính chịu hạn của các giống lúa bản địa theo hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã phân tích đa dạng di truyền tập đoàn 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR, với mục đích đưa ra nguồn thông tin hữu ích cho những nghiên cứu về tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen bản địa Việt Nam.


I. TỔNG QUAN VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY LÚA

1.1. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọn các cặp bố mẹ trong phép lai. Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu.

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận). Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như quy trình phức tạp. Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến trên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường. Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị hình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thông kê nên cần thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; thứ ba, có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được. Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các chỉ tiêu hình thái với việc xác định bằng chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN để đạt được kết quả chính xác nhất.

Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉ thị isozyme và các loại protein dự trữ.

Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau, vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạo thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phương pháp nhuộm. Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN  ARN  Protein.

Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein. Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế.

Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN. Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để lựa chọn tổ hợp lai.

Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính:

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP.

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR, ...)

1. 
   Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)
   

Kỹ thuật RFLP đã được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và cs. 1980) Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng với nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen, phân tích đa hình di truyền. Tuy nhiên, hạn chế của kỹ thuật này là tốn nhiều thời gian, công sức, kỹ thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòi hỏi ADN chất lượng cao.

2. 
   Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)
   

3. 
   Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ADN đa hình được nhân bội ngẫu nhiên)
   

Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích thấp, không cần biết những thông tin ban đầu về trình tự, dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn. Nhược điểm của kỹ thuật là nhạy cảm, phụ thuộc và điều kiện thí nghiệm, các thiết bị nghiên cứu và giai đoạn nghiên cứu. Mặt khác, RAPD là chỉ thị trội nên không thể nhận biết được cá thể dị hợp tử, khó nhận biết những đoạn cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng 1 vị trí trên hệ gen.

Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật nucleotide đơn giản là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể ít hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần. Phương thức lặp lại rất phong phú, được chia ra làm 3 kiểu lặp lại sau:

• Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau).

• Lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác).

• Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).

Chỉ thị SSR có ưu điểm so với các chỉ thị ADN khác:

- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự

sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR - PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên

- Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau. Do đó phản ứng SSR - PCR có thể phát hiện các allene khác nhau trong cùng một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử của locus đó.

Nhược điểm cơ bản của việc sử dụng chỉ thị này là: tốn công sức, giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN trong hệ gen chứa SSR, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài.

Phân tử ADN không chỉ khác nhau về trình tự mà còn khác nhau về hình dạng không gian khi ADN ở trạng thái sợi xoắn kép. Hai trình tự ADN chỉ cần có một vị trí nucleotide khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau. Bằng phương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa các đoạn ADN này (chỉ thị CS.GE- Conformation Sensitive Gel Electrophoresis).

Cùng với những thành tựu của công nghệ sinh học, nhiều loại chỉ thị mới đã được phát triển và ứng dụng, làm phong phú hơn những công cụ sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Với mục tiêu làm sáng tỏ hơn bản chất phân tử trong các nghiên cứu, các chỉ thị mới đi sâu vào phân tích trình tự ADN của các gen cụ thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…) giúp nghiên cứu đa dạng di truyền chính xác và chi tiết hơn. Tuy nhiên, những chỉ thị này yêu cầu kỹ thuật và chi phí cao hơn so với các loại chỉ thị ADN “thế hệ cũ” (RAPD, SSR, …). Đây được xem là điểm cơ bản hạn chế sự phổ biến của những chỉ thị này trong nghiên cứu đa dạng di truyền.

1.2. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa

1.2.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa trên thế giới

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của nhiều loại chỉ thị chỉ thị cũng như số lượng của mỗi loại chỉ thị đã làm tăng hiệu quả trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng trong với mục đích khác nhau. Chỉ thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay chọn giống phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả.

Tác giả Virk và cs.(1995) tiến hành nghiên cứu 12 giống lúa trồng ở châu Á đại diện cho các vùng sinh thái, địa lý khác nhau bằng chỉ thị RAPD. Kết quả cho thấy 18 trong số 24 mồi cho 83 băng, trong đó có 48 băng đa hình. Số lượng băng đa hình xuất hiện từ 1- 5 băng/mồi, các băng nằm trong khoảng 300 - 2700bp.

Tác giả Xu (2004) sử dụng 113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR để định lượng đa dạng allene của 125 giống lúa thu được từ các bang miền Tây và miền Nam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế IRRI. Các tác giả nhận thấy cơ sở di truyền các giống lúa hiện nay có ở Mỹ hẹp hơn nhiều so với các giống từ tập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR allele so với 96% và 92 RFLP so với 99%). Với 31 trong số 236 giống lúa có số lượng các allele cao (chiếm 95% số allele của RFLP và 74% số allele của SSR) có thể sử dụng làm tập đoàn hạt nhân. Kết quả cho thấy, chỉ thị SSR sử dụng hữu hiệu hơn RFLP cả về khả năng phát hiện các allele lẫn chi phí và kỹ thuật.

Tác giả Victoria và cs (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR. Trong số 164 chỉ thị SSR có 151 chỉ thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890, trung bình 5,89 allele/locus. Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm. Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 - 0,91, đạt trung bình 0,68/chỉ thị. Theo kết quả phân tích UPGMA, ở độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm 8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica. Nghiên cứu này cho ta thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của lúa, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao hơn và vì thế chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống.

1.2.2. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa tại Việt Nam

Việt Nam được xem là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di truyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng. Những nghiên cứu về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn chế. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm ứng dụng các kỹ thuật chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta.

Tác giả Bùi Chí Bửu (1999) đã sử dụng 20 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 72 giống lúa địa phương. Trong 20 mồi thử nghiệm thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng. Kết quả có hai nhóm chính bao gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở đồng bằng sông Hồng, lúa nước sâu của đồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp của Tây Nguyên và lúa nước trời của Duyên Hải Trung bộ.

Tác giả Nguyễn Đức Thành và cs (2001) đã sử dụng 10 mồi RAPD, 50 cặp mồi SSR, 15 cặp mồi AFLP để nghiên cứu 72 giống lúa nương. Kết quả cho thấy, các giống lúa nương có đa dạng di truyền cao và là nguồn vật liệu tốt phục vụ công tác chọn giống.

Tác giả Trần Danh Sửu và cs (2006) sử dụng 48 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 17 giống lúa Tám. Hệ số đa dạng gen thu được từ các giống lúa là 0,35. Số allele thu được trung bình 3,37 allele/mồi. 17 giống lúa này còn được phân loại Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của ADN lục lạp. Kết quả 17 giống lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica.

Tác giả Phạm Thị Bé Tư và cs (2008) đã đánh giá đa dạng của 90 giống lúa mùa địa phương bằng chỉ thị SSR. Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung bình là 0,88. Kết quả thu được từ 90 giống lúa mùa địa phương được phân thành 6 nhóm giống khác nhau.

- Tổng số có 40 giống lúa (Bảng 1), trong đó:

• 
  Có 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long
  
• 
  Có 01 giống lúa (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn.