ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr



tải về 325.9 Kb.
trang3/4
Chuyển đổi dữ liệu14.08.2016
Kích325.9 Kb.
#19268
1   2   3   4


2.2. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN: ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp "NaOH extraction" của Wang (1992). Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước:

  • Mẫu lá non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml. Thêm 200µl NaOH 0.25N. Nghiền mịn mẫu lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM 200.

  • Thêm 800µl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trộn đều.

  • Ly tâm 12.000vòng/phút trong 20 phút.

  • Chuyển 200µl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml. Lưu giữ ở -200C để làm dung dịch ADN gốc.

  • Pha loãng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5µl dung dịch ADN pha loãng cho mỗi phản ứng PCR

- Kỹ thuật PCR:

Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 5µl ADN, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.25 đơn vị Taq TaKaRa.

Điều kiện phản ứng PCR như sau: 950C - 7 phút; 35 chu kỳ của: 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 5 phút; giữ mẫu ở 40C. Sản phẩm PCR được phân giải trên gel agarose 3%.

- Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến.

Chuẩn bị gel agarose:

- Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng độ 3,0%.

- Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng.

- Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C.

- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml.

- Chuẩn bị khay gel và lược.

- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút.

- Tra sản phẩm PCR.

- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di.

- Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.



- Phân tích số liệu:

Những số liệu thống kê bao gồm số allen trên locus, tần số allele phổ biến nhất, số allele độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó:

- Chỉ số Tần số allele phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể xuất hiện allele phổ biến nhất trên tổng số allele xuất hiện ở từng locus nghiên cứu

- Allele độc nhất của từng chỉ thị SSR được xác định là allele xuất hiện duy nhất ở 1 giống trong toàn bộ các giống lúa nghiên cứu.

- Đa dạng di truyền allele của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình:

Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của alelel thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều allen được sinh ra.

Sự có mặt hay vắng mặt của các allele của từng chỉ thị SSR được ghi nhận cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí. Số liệu được nhập vào chương trình NTSYS-pc v. 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice, 1945; Nei and Li, 1979). Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).



III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tổng số 50 chỉ thị SSR để khảo sát đa hình với một số giống lúa đại diện, kết quả thu được 27 chỉ thị cho đa hình, số chỉ thị này tiếp tục được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền của toàn bộ 40 giống lúa trong nghiên cứu. Còn lại 23 chỉ thị không cho đa hình giữa các giống lúa hoặc cho băng sản phẩm mờ hoặc không cho sản phẩm PCR, nên đã bị loại bỏ khỏi nghiên cứu này.



Một số hình ảnh minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 giống lúa nghiên cứu với các chỉ thị SSR trên gel agarose 3.0% (Hình 1).

















Hình 1: Kết quả phân tích đa dạng di truyền 40 giống lúa sử dụng chỉ thị phân tử SSR trên gel agarose 3.0%
Bảng 3: Các chỉ tiêu về allele, chỉ số đa dạng PIC của các locus SSR nhận biết trên 40 giống lúa nghiên cứu

TT

Chỉ thị SSR

NST

Số allele

Tần số allele

phổ biến nhất

Số allele

độc nhất

PIC

1

RM145

2

8

39,024

1

0,778

2

RM152

8

9

43,636

2

0,727

3

RM267

5

6

38,235

0

0,765

4

RM566

9

8

48,718

1

0,721

5

RM1155

4

11

46,154

2

0,753

6

RM1364

7

9

44,444

3

0,748

7

RM1367

2

8

61,111

1

0,562

8

RM3288

4

6

34,375

0

0,777

9

RM3431

6

7

56,757

3

0,627

10

RM3455

12

5

31,476

2

0,791

11

RM3467

3

11

17,500

2

0,881

12

RM3468

1

9

31,707

1

0,827

13

RM3476

5

9

20,000

0

0,865

14

RM3483

12

5

35,294

1

0,732

15

RM3515

2

10

24,390

2

0,846

16

RM3534

4

6

27,027

2

0,761

17

RM5599

11

7

23,684

0

0,838

18

RM5811

1

5

43,590

2

0,644

19

RM6051

9

7

24,390

0

0,815

20

RM6648

1

6

57,107

3

0,762

21

RM7003

12

6

32,500

2

0,769

22

RM7372

9

5

32,500

0

0,756

23

RM7419

1

5

29,723

0

0,714

24

RM7654

11

5

38,182

0

0,709

25

RM8214

12

6

25,324

2

0,772

26

RM25271

10

7

39,024

1

0,760

27

RM25319

10

7

35,000

0

0,779

 

Tống số

 

193

 

33

 

 

Trung bình

 

7,1

36,329

1,2

0,759

 

Min

 

5

17,500

0

0,562

 

Max

 

11

61,111

3

0,881

Kết quả phân tích đa hình các chỉ thị SSR trong nghiên cứu của chúng tôi được tổng hợp trong Bảng 3. Với tổng số 27 locus SSR được phân tích, chúng tôi thu nhận được 193 allele, số allele/locus nằm trong khoảng từ 5 - 11, trung bình 7 allele/locus. Các locus cho ít allele nhất (5 allele) bao gồm các chỉ thị RM3455, RM3483, RM5811, RM7372, RM7654, RM7419; hai locus cho nhiều allele nhất (11 allele), đó là RM3467 và RM1155.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá và phân tích một số chỉ số như tần số allele phổ biến nhất, số allele độc nhất tại mỗi locus và chỉ số đa dạng PIC của từng locus SSR. Kết quả phân tích cho thấy, tần số allele phổ biến nhất giao động trong khoảng từ 17,5% đến 61,1%, tương ứng với chỉ thị RM3467 và RM1367. Số allele độc nhất cũng thay đổi từ 0 - 3 allele, trong đó một số chỉ thị không cho allele độc nhất, đó là các chỉ thị RM267, RM3288, RM3476, RM5599, RM6051, RM7372, RM7419, RM7654 và RM25319, có ba chỉ thị cho 3 allele độc nhất, là các chỉ thị RM1364, RM3431 và RM6648. Chỉ số đa dạng PIC của các locus trong nghiên cứu thay đổi từ 0,562 - 0,881, với giá trị trung bình đạt 0,759.

So sánh kết quả của nghiên cứu của chúng tôi với một số kết quả đã được công bố trong nước và trên thế giới (Bảng 4), chúng tôi nhận thấy số allele trung bình trong nghiên cứu thu được khá cao - là7,1 - trong khi một số nghiên cứu chỉ thu được số allele trung bình dưới 7 (Wong, 2009, Nagaraju, 2002; Alvarez, 2007, T.H. Herrera , 2008, S. B. Yu , 2003). Đặc biệt, khi so sánh về chỉ số đa dạng PIC giữa các nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy chỉ số PIC thu được trong nghiên cứu này có giá trị trung bình cao nhất (0,76), trong khi các nghiên cứu tương tự có giá trị PIC trung bình giao động từ 0,52 đến 0,74. Giá trị PIC trung bình phản ánh mức độ đa dạng chung cho tất cả các locus nghiên cứu. Điều này chứng tỏ những chỉ thị SSR được sử dụng trong nghiên cứu này đã cho kết quả đa dạng cao giữa các giống lúa nghiên cứu.


Bảng 4: Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây lúa

đã được công bố

TT

Tác giả

Số giống

Số chỉ thị

Tổng số allele

Trung bình

Số allele


PIC


Số allele độc nhất (allele hiếm*)

1

L.E.Giarrocco, 2007

69

26

219

8,4

0,69

1,7

2

S.C. Wong, 2009

8

12

31

2,6

0,52

-

3

J. Nagaraju, 2002

24

19

70

3,8

-

-

4

Alba Alvarez, 2007

50

10

66

6,6

0,74

1,4

5

J. Thomson, 2007

330

30

394

13,1

0,66

9*

6

T.H. Herrera , 2008

18

48

203

4,23

0,52

-

7

S. B. Yu , 2003

193

101

628

6,2

0,68

-

8

B.K. Chakravarthi, 2006

15

30

462

-

-

-

9

Nghiên cứu này

40

27

193

7,1

0,76

1,2

(*): allele hiếm là allele có tần số xuất hiện dưới 5%
3.2. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền của 40 giống lúa thông qua ma trận tương đồng (Bảng 5) và sơ đồ hình cây đã được thiết lập bằng phương pháp UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa (Hình 2). Kết quả cho thấy độ tương đồng di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu giao động từ 0,00 đến 0,78 với giá trị trung bình là 0,22, điều này cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về mặt di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu. Trong đó, hai giống lúa Khẩu sán - Khẩu đó đón (H37 - H38) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,78.

Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 0,14, tổng số 40 giống lúa trong nghiên cứu đã phân tách thành 4 nhóm riêng biệt:

- Nhóm I: Bao gồm 10 giống lúa với hệ số tương đồng Dice giao động trong khoảng 0,15 - 0,73 là H1, H9, H10, H11, H12, H14, H15, H19, H23, H24.

- Nhóm II: Gồm 24 giống lúa với hệ số tương đồng giao động từ 0,15 - 0,70. Tại hệ số tương đồng khoảng 0,23, các giống lúa thuộc nhóm này đã phân thành 3 phân nhóm chính:


  • Phân nhóm 1: Gồm 2 giống H2 và H3 với hệ số tương đồng 0,44

  • Phân nhóm 2: Gồm 8 giống là H6, H7, H8, H32, H33, H34, H35, H36 với hệ số tương đồng giao động từ 0,30 - 0,67

  • Phân nhóm 3: Gồm 14 giống là H13, H16, H17, H18, H20, H21, H22, H25, H26, H27, H28, H29, H30, H31 với hệ số tương đồng giao động từ 0,34 - 0,71.

- Nhóm III: Gồm 4 giống lúa với hệ số tương đồng di truyền từ 0,23 - 0,64 là H4, H5, H39, H40.

- Nhóm IV: Gồm 2 giống H37 và H38 với hệ số tương đồng di truyền là 0,78.



Kết hợp kết quả phân nhóm di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với những thông tin liên quan đến khả năng chịu hạn cũng như nguồn gốc của các giống lúa, chúng tôi đã chọn 8 giống lúa đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu hình chịu hạn tốt và có nguồn gốc khác nhau (Bảng 6). Đây sẽ là những giống lúa được chúng tôi sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu tiếp theo về tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen cây lúa địa phương Việt Nam.

Каталог: phenotype -> upload -> article
article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7)
article -> MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ
article -> Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN
article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5)
article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú
article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3
article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4
article -> Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng
article -> Xanthomonas oryzea pv oryze, đ
article -> ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa

tải về 325.9 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương