CHƯƠNG 2: ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2:
ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

• Mặt cắt 1: Thượng nguồn sông Nhuệ nơi ít bị ảnh hưởng bởi nước thải từ Hà Nội, tiến hành thu 3 điểm từ sông Hồng (đối chứng).

• Mặt cắt 2: Trên sông Nhuệ, khu vực đập Thanh Liệt (Hà Nội), nơi sông Tô Lịch chảy vào sông Nhuệ, tiến hành thu 3 mẫu trên sông Nhuệ, trước khi hợp lưu với sông Tô Lịch (Cầu Đen - Hà Đông), 3 mẫu sau khi hợp lưu với sông Tô Lịch (cầu Chiếc, Thường Tín), 3 mẫu ao nuôi cá sử dụng nước từ sông Nhuệ ở Thanh Trì, Hà Nội; và 3 mẫu từ các ao nuôi cá ở huyện Thanh Oai, Hà Nội.

• Mặt cắt 3: Tại ngã ba sông Nhuệ, sông Đáy và sông Châu Giang ở Phủ Lý. Thu thập 3 mẫu từ sông Đáy, 3 mẫu từ sông Nhuệ, 3 mẫu từ các ao nuôi trồng thủy sản sử dụng nước sông Nhuệ (Duy Tiên) và 3 mẫu từ các ao nuôi trồng thủy sản sử dụng nước từ sông Đáy (Thanh Liêm).

• Mặt cắt 4: Trên sông Đáy, nơi hợp lưu của sông Hoàng Long và sông Đáy (Ninh Bình). Thu 3 mẫu từ sông Đáy và 3 mẫu từ các ao nuôi trồng thủy sản ở xã Ninh Giang, Hoa Lư (Ninh Bình).

• Mặt cắt 5: Trên sông Đáy, dưới hợp lưu với sông Đào (Nghĩa Hưng, Nam Định). Thu thập 3 mẫu từ sông Đáy và 3 mẫu từ các ao nuôi cá sử dụng nước từ sông Đáy.

2.2 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU

Mẫu cá mè được thu thập trong bốn mùa của năm (bắt đầu vào mùa thu năm 2012 và kết thúc vào mùa hè năm 2013). Mẫu cá dùng nghiên cứu có trọng lượng khoảng 500 – 800g/cá. Trong mỗi mùa, cá được bắt từ sông Nhuệ, các ao NTTS ven sông và vận chuyển sống trong ngày về phòng thí nghiệm trong các túi bơm oxy.

Cá mẫu đối chứng được thu từ sông Hồng để so sánh với cá đánh bắt từ lưu vực sông Nhuệ - Đáy.

2.3 CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH

Khi cá được chuyển đến phòng thí nghiệm, các mẫu cá được sắp xếp theo địa điểm thu mẫu, sau đó, gây mê cá với MS222 0.5%, đo các chỉ số kích thước như tổng độ dài (cm) và trọng lượng cơ thể cá (g) của mỗi mẫu vật cá.

Cá được mổ trên khay đá lạnh và lấy các mẫu mang, gan và thận vào các ống eppendorf sạch đã cân bì. Trọng lượng của mỗi mẫu sau đó được cân và điều chỉnh khối lượng cho phù hợp với yêu cầu của từng phân tích. Cụ thể đối với các mẫu dùng cho phân tích KLN cân khoảng 20 - 100 mg trọng lượng tươi (mang, gan, cơ, thận); mẫu dùng cho phân tích protein và GST cân khoảng 5 - 10 mg (gan, thận) hoặc 10 - 20 mg (mang), mẫu phân tích glycogen cần khoảng 10- 30mg (gan, thận, mang). Trong suốt quá trình mổ và lấy mẫu, cá và mẫu được giữ trên đá lạnh. Mẫu ngay sau khi được lấy xong được giữ lạnh sâu ở nhiệt độ -80°C trong 300 µl dung dịch đệm TBS (protein) và 300 µl DPBS (GST), tới khi phân tích.

2.4 PHÂN TÍCH MẪU

2.4.1 Phân tích kim loại nặng

Mẫu mô được chuyển vào ống thuỷ tinh 40 mL đã chuẩn bị trước. Mẫu sau đó được vô cơ hoá bằng hỗn hợp axit HNO₃ 65% + HCL 30% theo tỉ lệ 4:1 và để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trước khi H₂O₂ 30% được cho vào và để yên trong 1 giờ nữa. Sau đó mẫu được xếp vào hộp nhựa chịu nhiệt kín và vô cơ hoá trong lò ở nhiệt độ 120°C trong khoảng 5 tiếng tới khi mẫu được vô cơ hoá hoàn toàn (trong và không có bọt). Mẫu được để nguội ở nhiệt độ phòng trước khi pha loãng với nước cất đến 20 mL và lọc bằng màng lọc xen-lu-lô 0.45 µm (cellulose filter) gắn với xi lanh 10 mL. Mẫu sau đó sẽ được cất ở 4°C trong vòng 2 tháng hoặc ở -20°C trong vòng 6 tháng đến khi đo nồng đồ KLN trên máy khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) [27]

Mỗi tập mẫu phân tích chuẩn bị một mẫu hiệu chuẩn kiểm chứng và 1 mẫu trắng (chỉ chứa hỗn hợp axit HNO₃ 65% + HCL 30% theo tỉ lệ 4:1) và cũng tiến hành các bước chuẩn bị như mẫu phân tích. Bằng cách đó cho phép chúng ta hiệu đính các sai số bất thường gây ra bởi qua trình vô cơ hoá và đo mẫu.

2.4.2 Phân tích protein

Mẫu được rã đông trên đá lạnh trước khi đem nghiền bằng máy nghiền mô (eppendorf chứa mẫu được đặt trên đá lạnh và ly tâm lạnh ở 9205 rpm, 4^oC trong 15 phút). Thu dung dịch nổi vào ống eppendorf mới. Cặn lắng được nghiền lại trong dung dịch Tris-buffered saline (TBS) và ly tâm lại thêm một lần nữa để thu càng nhiều protein càng tốt. Dung dịch nổi sau đó được giữa lạnh ở 0°C nếu phân tích trong ngày hoặc ở -20°C nếu phân tích trong tuần. Hàm lượng protein sẽ được xác định bằng phương pháp Bradford trên đĩa 96 giếng. Tóm tắt quy trình như sau: Hoà tan protein trong 100 µL mẫu đã nghiền và ly tâm ở trên với 900 µL dung dịch 0.01 N NaOH (hệ số pha loãng DF = 10), trộn mẫu đều bằng Vortexer trong khoảng 10 giây. Sau đó, để xác định protein tổng số sử dụng phương pháp Braford (1976) có cải tiến và có sử dụng BSA để xây dựng đường chuẩn. Dung dịch làm việc BSA 250 µg/mL được pha để chuẩn bị dãy chuẩn protein cho mỗi tập mẫu phân tích theo các hàm lượng protein trong khoảng 5 - 60 µg protein/mL bằng cách pha loãng với dung dịch đệm TBS. Chuẩn bị dãy chuẩn song song với quá trình thao tác mẫu; Ủ hỗn hợp mẫu pha loãng và dãy chuẩn trong 30 phút ở 60°C trong tủ sấy. Mẫu sau khi để nguội ở nhiệt độ phòng sẽ được phân tích với 3 lần lặp lại trên đĩa 96 giếng. Cụ thể, cho 30 µl dung dịch chuẩn hoặc mẫu vào mỗi giếng, sau đó cho tiếp 150 µl dd Bradford Reagent 3x (pha loãng 3 lần), lắc trong 30 giây. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 - 45 phút. Đo độ hấp thụ ánh sáng (mật độ quang) ở bước sóng 595 nm (kính lọc tham chiếu 495 nm). Độ hấp thụ của mẫu phải được ghi lại trước thời hạn 60 phút và trong vòng 10 phút. Vẽ đồ thị mật độ quang theo các nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn. Hàm lượng protein được xác định dựa trên đường chuẩn và chuẩn hoá cho trọng lượng ướt hoặc khô của mẫu mô (µg/g trọng lượng tươi hoặc mg/g trọng lượng tươi) [16]