TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên vũ triệU Ánh hồNG

2.4.3 Phân tích glycogen

Các bước tiến hành phân tích glycogen bằng đĩa 96 giếng: Hút 25 µl của mẫu và mẫu chuẩn vào các giếng. Thêm vào mỗi giếng 25 µl dung dịch phenol 8% và 140 µl H₂SO₄ đặc. Sau đó, sử dụng máy đọc và đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 495 nm, kính lọc tham chiếu 595 nm trong 30 phút [25,43].

Xác định hàm lượng glycogen của các mẫu phân tích bằng cách so sánh giá trị mật độ quang A495 với đường cong chuẩn, sử dụng phương trình “y = ax + b”, trong đó y = độ mật độ quang ở 495 nm và x = hàm lượng glycogen. Hàm lượng glycogen được xác định dựa trên đường chuẩn và chuẩn hoá cho trọng lượng ướt hoặc khô của mẫu mô (µg/g w.w. or mg/g w.w.) [25,43].

Bảng 2.1: Chuẩn bị dãy chuẩn glycogen

Hoạt tính GST được xác định bằng phương pháp Habig (1974): Mẫu được nghiền và ly tâm ở 4°C, 9.000xg (tương đương 9205 rpm đối với máy ly tâm 5417R Eppendorf) trong 30 phút. Lặp lại quy trình trên hai lần và kết hợp phần dung dịch nổi phía trên (supernatant) thu được từ hai lần ly tâm vào 1 ống eppendorf và giữ trên đá. Phần dung dịch nổi kết hợp này đã sẵn sàng cho việc xác định hoạt tính của GST. Dung dịch phản ứng bao gồm hỗn hợp của 100 mM DPBS đệm (pH = 6,5), 200 mM GSH và 100 mM CDNB có nồng độ là 2 mM GSH và 1 mM CDNB. Phản ứng được bắt đầu bằng cách trộn 0,98 hoặc 0,95 ml hỗn hợp phản ứng với 0,02 hoặc 0,05 ml mẫu, tương ứng và độ hấp thụ của từng mẫu được đo 1 phút/ 1 lần trong vòng 7 phút ở 340 nm sử dụng máy đo quang phổ nhiệt Sciencetific TM Biomate. Cứ mỗi tập mẫu đo có một mẫu trắng (có chứa 1 ml dung dịch chất nền). Hoạt tính của enzyme được xác định lặp lại 2 lần và được thể hiện bằng µmol chất nền bị thuỷ phân trong 1 phút, trên 1 mg protein [32]

Hoạt tính của GST đã được tính toán dựa trên công thức với các hệ số được tính toán bằng cách sử dụng các yếu tố thay thế 9,6 mM^-1cm^-1 và cuối cùng tính nmol GSH-CDNB conjugate / phút / mg protein [32]

2.5 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Tất cả dữ liệu đã được trình bày là giá trị trung bình ± SEM. Sử dụng phần mềm GraphPad InStat, sự khác biệt về hàm lượng protein, GST và hàm lượng KLN trong từng loại mô, được đánh giá bằng cách phân tích phương sai một nhân tố (one- way ANOVA) và tiếp theo là dùng chương trình so sánh nhiều biến Student-Newman-Keuls để kiểm định mức độ khác biệt giữa các biến số. Mức độ ý nghĩa của các phép kiểm định được ấn định bởi dấu hoa thị như sau: * = 0,05 ≥ p ≥ 0,01, ** = 0.01 ≥ p ≥ 0.001, và *** = p ≤0.001.

Mối tương quan giữa các biến (hàm lượng KLN tích lũy và hàm lượng protein, GST hay glycogen trong cùng mẫu phân tích) được kiểm định bằng phương pháp kiểm định có tham số (parametric tests) hoặc phi tham số (nonparametric tests) tùy vào số liệu có tuân theo phân bố chuẩn hay không. Kiểm định mức độ tương quan bằng phương pháp phân tích tương quan Pearson hoặc Spearman (p < 0,05) tùy vào tập dữ liệu. Nếu các biến tương quan có ý nghĩa, thì sau đó nó được phân tích bằng hồi quy đơn giản. Ý nghĩa thống kê được ấn định tại p <0,05.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐÁNH GIÁ SỰ TÍCH TỤ KIM LOẠI NẶNG CỦA CÁ MÈ TRONG LƯU VỰC SÔNG NHUỆ - ĐÁY

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy nồng độ KLN Cu, Zn, Cd, Pb tích tụ trong các mô nghiên cứu của cá mè ở LVS Nhuệ - Đáy khá cao và có biến động theo mùa. Ở tất cả các mẫu mô (mang, gan, thận, cơ), Zn có nồng độ cao nhất, theo sau lần lượt là Cu, Pb và thấp nhất là Cd. Nguyên nhân do Zn, Cu đều là các kim loại thiết yếu, trái ngược với Cd và Pb, do đó chúng được tích lũy với nồng độ cao hơn trong các loại mô; mặt khác nồng độ Zn, Cu hòa tan trong nước của LVS cũng cao hơn nồng độ Cd, Pb [7]. Trong số các cơ quan nghiên cứu, gan và thận là hai cơ quan có xu hướng tích tụ KLN nhiều hơn cả. Theo mùa thì các mẫu mô lấy vào các mùa khác nhau đều có sự biến động hàm lượng tích tụ KLN là khác nhau.

Nhìn chung, hàm lượng Cu trong các mô nghiên cứu có xu hướng cao nhất vào mùa hạ, sau đó đến mùa xuân và thấp nhất vào mùa đông (bảng 3.1).

- Biến động của hàm lượng Cu trong từng loại mô cá theo các mùa:

+ Mang: Có sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kế giữa hàm lượng Cu trung bình của mang trong các mùa (P<0,0001). Đặc biệt, Cu trong mang vào mùa thu thấp hơn hẳn so với mùa hạ (P<0,001) và mùa xuân (P<0,01). Sự khác biệt giữa mùa thu với mùa đông, mùa đông với mùa xuân đều không có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05).

+ Gan: Giá trị P = 0,171>0,05, cho thấy không cósự khác nhau về mặt thống kê của hàm lượng Cu giữa các mùa khảo sát trong năm.

+ Thận, cơ: Phân tích phương sai cho thấy hàm lượng Cu của thận và cơ có sự khác nhau giữa các mùa trong năm và sự khác nhau này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,0001). Trong đó, hàm lượng Cu trong hai loại mô này về mùa hạ cao hơn hẳn các mùa khác trong năm (P<0,001). Không thấy có sự khác biệt về hàm lượng Cu trong cả thận và cơ giữa các mùa xuân, thu và đông (P>0,05).

- Biến động của hàm lượng Cu trong các mô khác nhau trong cùng một mùa:

Kết quả phân tích phương sai cho thấy có sự khác nhau rõ rệt giữa hàm lượng Cu của các mô trong mùa thu (p< 0,0001), mùa đông (p< 0,0001) mùa xuân (p = 0,0016) và mùa hạ (p<0,0001). Nhìn chung, hàm lượng Cu trong mô gan cao nhất, tiếp theo là mô thận, mang và cuối cùng là cơ, trong tất cả các mùa trong năm. Tuy nhiên, chỉ có mô gan là cao hơn hẳn các mô khác và sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (p< 0,001) trong cả 4 mùa xuân hạ thu đông. Còn lại, không tìm thấy sự khác biệt giữa các mô thận, mang và cơ (p>0,05) trong tất cả các mùa trong năm.

3.1.1.2 Sự biến động của hàm lượng Zn tích lũy trong mô cá theo mùa

- Biến động của Zn trong từng loại mô cá theo các mùa:

Ở tất cả các loại mô nghiên cứu, sự biến động về hàm lượng Zn theo các mùa khác nhau không nhiều và không có ý nghĩa về mặt thống kê (p= 0,34, p = 0.58, p= 0.25, p = 0.99>0,05).

- Biến động của hàm lượng Zn trong các mô khác nhau trong cùng một mùa:

Khi phân tích phương sai cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kế giữa hàm lượng Zn trung bình trong các loại mô khác nhau trong mùa thu (p = 0,0003), mùa đông (p = 0,0038), mùa xuân (p=0,0136) và mùa hạ (p=0,0139).

Xu hướng chung là trong tất cả các mùa, hàm lượng Zn trung bình đều cao hơn hẳn ở gan, sau đó là thận, mang và thấp nhất là cơ.

3.1.1.3 Sự biến động của hàm lượng Cd tích lũy trong mô cá theo mùa

- Biến động của Cd trong từng loại mô cá theo mùa:

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy có sự bến động của hàm lượng Cd theo mùa ở tất cả các mô cơ quan. Nhìn chung, hàm lượng Cd trung bình trong mang, gan, cơ đều có xu hướng cao nhất vào mùa hạ. Riêng hàm lượng Cd trung bình trong thận cao nhất vào mùa đông.

Phân tích phương sai cho thấy có sự khác biệt rõ rệt có ý nghĩa thống kê giữa các mùa về hàm lượng Cd trung bình ở mang (p<0,0001) và ở cơ (p=0,002), nhưng không có sự khác biệt ở gan (p=0,46) và ở thận (p=0,058). Trong đó, Cd ở mang hay ở cơ vào mùa hạ đều cao hơn hẳn mùa thu, mùa đông và mùa xuân (p<0,001).

- Biến động của hàm lượng Cd trong các mô khác nhau trong cùng một mùa:

Hàm lượng Cd tích tụ trong các loại mô ở cả 4 mùa đều có xu hướng cao nhất ở thận, tiếp sau đó là ở gan, mang và thấp nhất ở cơ. Đặc biệt, khi phân tích phương sai cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa hàm lượng Cd trung bình giữa các mô cá nghiên cứu vào mùa thu (p=0,0001), mùa đông (p=0,0001), mùa hạ (p=0,024). Hàm lượng Cd tích tụ trong thận lớn hơn so với gan, mang và cơ trong mùa thu, mùa đông (p<0,001) và mùa hạ (p<0,05). Trong khi đó, không có sự khác biệt nào giữa hàm lượng Cd tích tụ trong gan, mang và cơ được tìm thấy (p>0,05).

3.1.1.4 Sự biến động của hàm lượng Pb tích lũy trong mô cá theo mùa

- Biến động của Pb trong từng loại mô cá theo mùa:

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy có sự biến động Pb theo mùa ở tất cả các mô cơ quan. Hàm lượng Pb trong mang, gan, thận, cơ đều cao vào mùa xuân và mùa hạ, thấp vào mùa thu và mùa đông.

Kết quả phân tích phương sai cho thấy có sự sai khác rõ rệt về hàm lượng Pb giữa các mùa trong ba loại mô là mang (p=0,004), gan (p<0,0001) và thận (p=0,0125). Đặc biệt, hàm lượng Pb trung bình ở mang vào mùa xuân cao hơn hẳn so với mùa thu (p<0,01), mùa đông (p<0,05); ở thận vào mùa hạ cao hơn hẳn so với mùa thu (p<0,01), mùa đông (p<0,05); ở gan cao nhất vào mùa hạ và cao hơn hẳn so với mùa xuân, mùa thu và mùa đông (p<0,001).

Kết quả phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt hàm lượng Pb trung bình trong cơ giữa các mùa trong năm p>0,05).

- Biến động của Pb trong các mô cá khác nhau trong cùng một mùa:

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy hàm lượng Pb trung bình trong các mùa có xu hướng cao hơn ở mô mang, gan thận, và thấp ở mô cơ. Phân tích phương sai cho thấy hàm lượng Pb trung bình giữa các mô nghiên cứu có sự khác biệt có ý nghĩa vào mùa đông (p=0,04) nhưng không thấy ở các mùa khác trong năm (p>0,05). Xu hướng Pb tích tụ vào mùa đông thấp nhất ở mô cơ, thấp hơn hẳn so với mô gan (p<0,01) và mô thận (p<0,05), nhưng lại không khác so với mô mang (p>0,05).