TrƣỜng đẠi học an giang khoa nông nghiệp và TÀi nguyên thiên nhiêN
PHƢƠNG PHÁP ĐO ĐỘ HẤP THU ABS BẰNG MÁY SO MÀU
tải về 4.19 Mb. Chế độ xem pdf
|
| 6. PHƢƠNG PHÁP ĐO ĐỘ HẤP THU ABS BẰNG MÁY SO MÀU
SPECTROPHOTOMETER Một trong những phƣơng pháp phân t ch hữu hiệu nhất trong sinh học là phƣơng pháp phân t ch so màu. Trong phƣơng pháp này, nồng độ của hợp chất màu đƣợc xác định bằng cách đo cƣờng độ màu của dung dịch chứa hợp chất màu đó. Trong hóa sinh các phƣơng pháp đo quang phổ thƣờng đƣợc đo trong dãy bƣớc sóng khoảng 220 - 800 nm. Dãy quang phổ này lại đƣợc chia thành vùng tử ngoại (380 nm) và vùng hồng ngoại (800 nm). Vùng hồng ngoại rất ít ứng dụng trong hóa sinh. Còn vùng khả biến (ánh sáng trắng) lại đƣợc dùng trong phƣơng pháp phân t ch so màu. Để biết so màu đƣợc đo nhƣ thế nào. Trƣớc hết ta phải hiểu đƣợc màu là gì? Khi dòng ánh sáng trắng xuyên qua một dung dịch màu, các bƣớc sóng nhất định sẽ bị hấp thụ trong khi những bƣớc sóng khác hầu nhƣ không bị ảnh hƣởng. Màu của dung dịch sẽ là màu của bƣớc sóng không hấp thụ. Cƣờng độ màu của dung dịch có thể đƣợc xác định bằng cách đo cƣờng độ ánh sáng hấp thụ bởi hợp chất màu có trong dung dịch. Vì dùng ánh sáng trắng để đo cƣờng độ màu, nên ánh sáng hấp thu cách càng xa càng tốt những bƣớc sóng không hấp thụ bởi dung dịch màu tốt nhất là dùng ánh sáng của một bƣớc sóng riêng (ánh sáng đơn sắc). Ánh sáng đơn sắc có thể đƣợc tạo ra từ giấy lọc, ăng k nh hoặc cách từ nhiễu xạ trong máy so màu và máy quang phổ. Định luật Lambert – Beer: Log 10 = Kcl Trong đó: I 0 : cƣờng độ của tia tới. I e : cƣờng độ của tia đi ra. K: hệ số tắt hoặc chỉ số hấp thu phân tử. c: nồng độ của dung dịch. l: chiều dài của ánh sáng qua dung dịch (thƣờng là một dung dịch). Log 10 mật độ quang (OD - optical density) hay khả năng hấp thu (A - absorbensy). Trong thực hành giá trị này không phải t nh mà thu đƣợc trực tiếp từ máy đo. Từ công thức ta dễ dàng nhận thấy rằng độ dài đƣợc giữ không đổi thì mật độ quang sẽ tỷ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chất màu. Vì vậy, đƣờng chuẩn có thể đƣợc vẽ từ dãy các dung dịch chuẩn với những nồng độ khác nhau. Pc10 Khi tăng chiều dài ( ) cũng nhƣ tăng nồng độ của dung dịch thì mật độ quang (OD) sẽ tăng tỷ lệ thuận với chúng chứ không phải độ hấp thụ ánh sáng. Trong nhiều trƣờng hợp độ hấp thụ và nồng độ của dung dịch không tỷ lệ thuận. Do đó, cần phải xác định giới hạn nồng độ dung dịch và chỉ áp dụng định luật Lambert - Beer ở phần nồng độ tăng tuyến tính. Khi quan hệ giữa hai yếu tố này không phải à đƣờng thẳng tuyến t nh thì không dùng đƣợc công thức Lambert - Beer. Trong trƣờng hợp này phải xây dựng một đƣờng chuẩn. Để so màu ngƣời ta chọn điều kiện sao cho mật độ quang (OD) nằm trong khoảng 0,1 ÷ 1, tốt nhất là 0,2 ÷ 0,5. tải về 4.19 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|