Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc
tải về 0.52 Mb. Chế độ xem pdf
|
| Kỹ thuật đa hình tiểu vệ tinh được nhân bản
ngẫu nhiên (Randomly Amplified Microsatellite Polymorphisms-RAMP) Các kỹ thuật chỉ thị dựa vào tiểu vệ tinh cho mức độ đa hình allele cao nhưng lại tốn nhiều công sức. Kỹ thuật RAPD không tốn kém nhưng mức độ đa hình thấp. Để dung hoàn yếu điểm của hai kỹ thuật này, kỹ thuật RAMP được xây dựng [201]. Kỹ thuật này sử dụng mồi được đánh dấu chứa đầu 5’ neo và đầu 3’ lặp lại để nhân DNA genome với sự có mặt hoặc vắng mặt các mồi RAPD. Sản phẩm nhận được phân tách trên gel polyacrylamide biến tính. Do mồi
Các kỹ thuật chỉ thị DNA
273 lặp lại được đánh dấu nên chỉ có sản phẩm của mồi neo được xác định. Nhiệt độ bắt cặp của mồi neo thường cao hơn mồi RAPD 10-15 o C. Vì vậy, ở nhiệt độ bắt mồi cao chỉ có mồi neo được kéo dài hiệu quả. Ỏ các chu kỳ PCR với nhiệt độ bắt mồi thấp, cả hai mồi neo và mồi RAPD đều kéo dài. Do đó chương trình PCR được thiết lập sao cho có sự chuyển giữa nhiệt độ bắt mồi cao xuống thấp trong quá trình phản ứng. Hầu hết các phân đoạn nhận được chỉ với các mồi RAMP sẽ biến mất khi có các mồi RAPD và các mẫu băng khác nhau nhận được bởi cùng một mồi RAMP và các mồi RAPD khác nhau cho thấy các mồi RAPD cạnh tranh với mồi RAMP trong chu kỳ với nhiệt độ bắt mồi thấp. RAMP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây như lúa mạch [157, 201] và đào [33].
Gen nhảy là các yếu tố di truyền có khả năng thay đổi vị trí của chúng trong hệ gen. Gen nhảy được phát hiện đầu tiên ở ngô [111]. Có hai loại gen nhảy. Loại I là gen nhảy ngược (retrotransposon), đây là yếu tố ngắn và dài nằm rải rắc trong nhân, là yếu tố mã hóa mRNA và có mức thay đổi vị trí trung bình. Hiện tượng gen nhảy loại I tạo ra các bản sao mới trong khi bản gốc vẫn giữ nguyên ở vị trí ban đầu. Các bản sao được tạo ra theo hai giai đoạn: đầu tiên là phiên mã từ DNA thành RNA và tiếp theo là RNA tạo thành được phiên mã ngược thành DNA. Bản sao mới được gắn vào vị trí mới trong genome. Gen nhảy loại II (gen nhảy DNA) cấu tạo bởi gen nhảy DNA, loại này thay đổi vị trí bằng cơ chế “cắt và gắn” [56]. Chúng tự rời khỏi vị trí ban đầu gắn vào vị trí tiếp nhận. Dựa vào đặc điểm cấu trúc, gen nhảy còn phân chia thành dưới nhóm, trên họ, họ và dưới họ dựa trên sự định hướng của các khung đọc mở; vào sự có mặt, định hướng, độ dài và trình tự lặp lại bên trong và vào độ dài và trình tự nhân đôi ở vị trí đích tạo nên do sự thêm nucleotide [56]. Gen nhảy ngược (retrotransposons) hay gen nhảy loại I chia thành hai nhóm phụ khác nhau ở cấu trúc và chu kỳ chuyển vị đó là gen nhảy có đầu lặp lại dài (Long Terminal Repeat (LTR) retrotransposon) và gen nhảy không có đầu lặp lại dài (non-LTR retrotransposon) bao gồm yếu tố LINE (Long INterspersed repetitive Element) và SINE
(Short INterspersed repetitive Element). Hai nhóm phụ này được phân biệt bằng sự có mặt và vắng mặt đầu lặp lại dài (LTR) ở đầu. Tất cả các nhóm đều được bổ sung các dạng không phụ thuộc tương ứng thiếu một hoặc nhiều gen quan trọng cho sự chuyển vị như: các yếu tố có đầu lặp lại ngược nhỏ (Miniature Inverted repeat Terminal Elements- MITEs) cho nhóm II, SINEs cho non-LTR retrotransposons và gen nhảy ngược có đầu lặp lại nhỏ (Terminal-Repeat retrotransposons In Miniature-TRIMs) và phiên bản gen nhảy lùi lớn (large retrotransposon derivatives-LARDs) cho LTR retrotransposons. Gen nhảy ngược (retrotransposons) cho phép tạo ra hệ chỉ thị phân tử tuyệt vời bởi chúng có chuỗi dài và bảo thủ, đa hình thêm nucleotide được tạo ra bởi hoạt động sao chép. Việc bổ sung nucleotide mới giúp cho việc tổ chức các hiện tượng bổ sung tạm thời trong dòng giống và như vậy có thể sử dụng để xác định phả hệ và phát sinh loài [63]. Phân tích phân tử dựa vào gen nhảy ngược được thực hiện với việc nhân bản bằng mồi tương ứng với gen nhảy và mồi phù hợp với vùng gen bên cạnh. Đa hình gen nhảy có một số kỹ thuật sau: Kỹ thuật đa hình chuỗi đặc thù được nhân bản (Sequence-Specific Amplified Polymorphism- S-SAP) là nhân bản DNA nằm giữa vị trí gắn của gen nhảy và vị trí cắt hạn chế cùng với chuỗi tiếp hợp [193]; kỹ thuật đa hình gen nhảy ngược giữa được nhân bản (Inter-Retransposon Amplified Polymorphysm-IRAP) là nhân bản chuỗi DNA nằm giữa hai gen nhảy gần nhau hoặc chuỗi lặp lại cuối trực tiếp dài (Long Terminal Direct Repeats-LTR) được nhân bản; kỹ thuật đa hình tiểu vệ tinh gen nhảy ngược được nhân bản (Retrotransposon-microsatellite Amplified Polymorphism-REMAP) được tiến hành bằng việc nhân bản phân đoạn nằm giữa vị trí gắn của gen nhảy và vị trí tiểu vệ tinh; kỹ thuật đa hình về vị trí gắn (insersion) dựa vào gen nhảy
ngược (Retrotransposon-based Insersion Polymorphism-RBIP) được sử dụng để xác định các locus bị gen nhảy chiếm hoặc |